[求救] plasmid rescue
各位板友好
目前我在從事的實驗是
鑑定水稻轉殖株t-DNA插入的位置
所用的protocol如下
1. 抽取水稻gDNA，取5ug用Spel進行截切overnight
2. 65度inactivate enzyme，加入NaOAC與IPA沉澱，再用70% EtOH wash，離心
3. 以分生用去離子水回溶利用T4 DNA ligase進行ligation overnight
4. 65度inactivate enzyme，以heat shock的方式進行transformation
5. 利用含有Amp的medium進行篩選
6. 挑colony，抽plasmid，以Xbal進行digestion check
利用Xbal截切的結果
應該要有一條3.3 kb與另一條大於3.7 kb的band
但是大部分出來的結果
不是一條band
就是size不合
我知道這個方式成功率本來就不高
所以想請問各位版友
如何修改protocol以增加實驗成功率
謝謝
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