[方法] protein denaturation
大家好
小弟目前在純化蛋白的時候遇到了一些瓶頸
小弟的目標是從e-coli中純化出重組蛋白
並且之後希望可以進行EMSA等能測activity的實驗
我的target protein絕大部分為solube form，inclusion body內的量很少
而我發現我的target protein會跟另外一個protein有hydrophobic interaction
我用的是TALON的Cobalt resin 抓His-tag
鹽濃度落在300~500mM 同時裡面也有加0.4%的NP-40及10%Gcerol
同時也wash很多次了 還是會有contamination
每當純化下來的時候 都會一起純化下來
而且量還不少..滿多的orz
現在我想到的方法是利用Urea先去denature這些蛋白
只是是否單純要denature蛋白也需要用到8M的高濃度??
因為表現量不高 所以在renature透析的時候會lost掉不少
不知道能不能用低點的濃度去denature以減少透析的次數??
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.98.145
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我在Host內表現三四種蛋白 其中2個是substrate (暫且稱為A) & SUMO-His
另外兩個是SUMOylation的E1、E2
已經確定會在host內進行sumoylation 而產生isopeptide bond
我想要純化這個A-SUMO-His
因為發現說不管怎麼做都會把我要的target跟A都純化下來
猜測應該是A上有motif跟SUMO作用 (突變掉之後，會改善很多，但是無法完全克服)
而查了paper是hydrophobic interaction
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不好意思 不太懂高鹽大概是指多高呢?另外我全程都是在4度操作
※ 編輯: FUSION87 來自: 140.114.98.145 (10/14 19:21)
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