[求救] EMSA的supershift
這是我幫同學代po的,請有EMSA經驗的大大看一下m(_ _)m
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我的EMSA的supershift一直做不出來,
而且smear超嚴重,完全看不清楚band,
我們是用Thermo Scientific的EMSA的kit去做,p65的抗體是millipore,
我們一開始有跟著學長姐的方法做,一開始有做出來,但是不明顯,
後來就完全失敗,最後我們有試著調整抗體的量,
由3.5ul->1ul,1ul是抗體的datasheet建議的量,但完全做不出來,
可是應該不是抗體的問題,因為我們一開始就是採分裝的,每次都會拿新的,
至於smear的問題,我們有試著調高poly(dI-dC)的量,另外又加入6%的bsa,
但smear還是非常嚴重!
這是我們設的條件:
p65 antibody ctl
DDW 3-X 4-X
10X binding buffer 1 1
1μg/μl poly(dI-dC) 3 3
50% glycerol 1 1
1% NP-40 1 1
100mM MgCl2 1 1
6%BSA 1 1
40 pmol/μl unlabeled NF-κB DNA 0 0
P65 1 0
protein extract X X
200 fmol/ul biotin-labeled NFκB DNA 1 1
total volume 13μl 13μl
請問各位大大supershift做不出來以及smear嚴重,
可能的原因和可以改進的地方在哪裡嗎?
感謝!!
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09/15 12:55, , 1F
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