[求救] 3'RACE的瓶頸

看板Biotech作者raxjimmy (反串正夯)時間16年前 (2009/09/14 18:21)推噓1(1推 0噓 12→)

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夾一個基因的mRNA已經夾四個月了..... 目前已經夾到一個片段用那個片段做了兩條primer來做3'RACE 一般在做3'RACE的時候第一股cDNA都是用oligo dT去做RTPCR 之後得到的cDNA再用specific primer 和 dT 去夾我做RTPCR的條件是25度 5min => 42度 60min => 72度 15min 之前是因為還沒有夾到RNA的sequence 所以之後PCR的部分是用degenerated primer夾我要的RNA squence 也順利夾到了預期大小的片段之後做aligment 也確定是我要的基因沒錯但是現在麻煩的來了原本以為接下來做RACE用的primer是專一性的應該會好做很多可是接下來怎麼P都是smear 溫度換過了我也有試過DMSO 然後也買了其他的Taq試過但是怎麼夾都是那樣如果之前可以夾到片段表示RTPCR應該是沒問題 PCR的條件用94 42-62 72 aneal的溫度只要低於50大概就看不到東西了高於50一直到59都是smear..... 而且最扯的是第一次的35cycle完全看不到產物要取1ul出來重新再P 35cycle才看的到 RNA的品質我用之前那一組degenerated primer驗收過沒有問題那...RNA沒問題 RTPCR沒問題就是PCR的問題摟... 那我的PCR哪邊出了問題呢? 各種條件都換過了 primer在RT也驗證過是可用的 forward 也是同一家公司出品品質應該無慮 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.13.115.38

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sGoat

09/15 14:24, , 1^F

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sGoat

09/15 14:28, , 2^F

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raxjimmy

09/17 21:55, , 3^F

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