[求救] Real-Time PCR 結果不穩定

看板Biotech作者 (白烏鴉)時間16年前 (2009/09/04 01:02), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
留言16則, 8人參與, 7年前最新討論串1/1
小弟最近正在做小鼠脂肪組織的 Real-Time PCR 使用的機器是 Bio-Rad icycler ,SYBR Green Mix 則是 Bio-Rad 原廠 PCR Tube 是 96 well plate 可分成四等份那種　再用 Seal 貼紙封住 小鼠的分組是每組5隻　共4組 跑Real-Time時 也是每組 n=5 共4組 不再做同sample的重複　 house keeping gene 是用 HPRT 沒有做 standard curve 跑出來的結果　melting curve 都是 single peak CT 值也都在 15~30 之間 但是不同組別間 HPRT的表現量常常會差到2~4倍 (也就是CT值差了1~2) normalized後　traget gene 的表現量差異　幾乎都是因為HPRT的差異造成 error bar也時高時低.. 請問這樣的data是否可以相信呢?　應該要怎麼改進? 除此之外　我想請教一些Real-Time PCR loading的技巧 像是如何不產生氣泡 需不需要按到第二段　以及 loading 的順序等等 (我只知道不可以杯壁下流再去離心..Bio-Rad　Specialist說的) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.160.62.210 ※ 編輯: nexusfantasy 來自: 218.160.62.210 (09/04 01:08)
推
09/04 16:36, , 1F
我也想問這個問題~但是我學姐告訴我體積ㄧ定要準~我做二
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09/04 16:37, , 2F
重複,只要pipetteman跑掉一點點~就會差很多...
09/04 16:37, 2F
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09/04 16:38, , 3F
產生氣泡應該還好, 按到第二段以後沿著管壁拉上來~
09/04 16:38, 3F
推
09/04 18:18, , 4F
作real-time盡量不要pipetting 延著管壁接近液體慢慢加
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09/04 18:18, , 5F
另外，可以做3重複 避免偏差太大
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推
09/05 15:46, , 6F
氣泡一加熱應該就會消失了
09/05 15:46, 6F
推
09/05 22:17, , 7F
我以前做都不按到第二段，會pipetting。另外，會稍微spin
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09/05 22:18, , 8F
down去消氣泡
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09/07 11:24, , 9F
pipetting應該沒有影響到很大...氣泡按住TUBE稍微輕彈
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09/07 11:25, , 10F
也會消失...建議還是要做二重複比較同一SAMPLE的CT值...
09/07 11:25, 10F
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09/07 15:13, , 11F
我是用羅氏的LightCycler 廠商說材料一定要混合均勻...
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09/07 15:14, , 12F
另外至少要做兩重複 三重複則比較保險 去除明顯偏差的值
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09/09 17:52, , 13F
建議先練習作standard curve, R2一定要大於0.99
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11/11 01:43, , 14F
氣泡一加熱應該就會消失 https://daxiv.com
11/11 01:43, 14F
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01/03 17:00, 7年前 , 15F
//daxiv.com
01/03 17:00, 15F
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01/03 17:00, 7年前 , 16F
01/03 17:00, 16F
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