[求救] DNA難溶~!

看板Biotech作者 (Mei-Mei)時間15年前 (2009/08/11 21:53), 編輯推噓10(10推 0噓 28→)
留言38則, 9人參與, 5年前最新討論串1/1
這兩天用TRIzol抽取DNA 然後卡在最後一步的回溶步驟>"< 我把DNA pellet dry的很乾以後(大約放在高處5min) 再回溶在NaOH裡面~並且放置在乾浴器55度C環境約略30min~ 但是eppendorf底部的管璧上還殘留一些霧霧的東西 好像是pellet黏在管璧上面了~ 我擔心放太久DNA會壞掉 就直接拿去nanodrop測OD 我吸了比較上面的液體~出現了兩個peak>"< 然後又吸了eppendorf底部的管璧(有點稠稠像鼻涕一樣)結果DNA的濃度竟然爆走 測到一個peak但是濃度3000ng/ul... 我稍微看了一下 A260/A280 ratio是1.88 這樣應該是有抽到DNA吧~? 但是濃度有點不正常~之前學姊的濃度都100以內= =@@ 我懷疑應該是DNA還在管子底部沒有溶掉才會這樣... 學姊是建議我先將DNA放置在4度C冰箱明天在來繼續回溶 但是我今天都放30min了!覺得有點危險~ 請問各位經驗豐富的前輩們我要怎麼改善DNA難溶的問題? 到底我哪一步錯了?(查資料上是寫DNA不能dry太乾) 如果真的不能溶,還是不是可以拿來跑PCR?(因為明天可能要跑PCR) 欸~第一次抽DNA好不容易抽出來了..真的不想敗在回溶這一步阿.. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.150
推
08/11 21:55, , 1F
RNA?
08/11 21:55, 1F
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08/11 22:01, , 2F
是DNA~因為TRIzol可以抽DNA跟RNA~這次我要的是DNA
08/11 22:01, 2F
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08/11 22:02, , 3F
RNA也一起抽了~但是有溶完全~而且也不是馬上要做
08/11 22:02, 3F
推
08/11 22:37, , 4F
熱過的水(60'C) TE buffer試過了嗎
08/11 22:37, 4F
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08/11 23:16, , 5F
沒有耶~因為照著protocal已經加了NaOH~因為學姊已經做完了
08/11 23:16, 5F
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08/11 23:18, , 6F
沒有什麼問題...改TE BUFFER真的會比較好嗎??
08/11 23:18, 6F
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08/11 23:20, , 7F
如果真的有必要再加TE 下去~該加多少比較好?
08/11 23:20, 7F
推
08/11 23:59, , 8F
我記得DNA跟RNA不能全乾耶 會難溶
08/11 23:59, 8F
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08/12 00:01, , 9F
然後TRIzol上有說8mM NaOH回溶後 以>12000g離心10min 去除
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不溶物質(如膜etc.) 留上清液
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推
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如果真的不溶的話 要不要試著把它丟到60度水浴?
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08/12 00:12, , 12F
水浴或加熱可以加多久呢??因為我今天已經放56度30min了
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加熱太久是不是不好呀? 怕DNA壞掉之類的
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推
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既然都熱那麼久了 那就把那些東西離掉好了 我是看TRIzol附
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的protocol寫的來做
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推
08/12 00:23, , 16F
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08/12 00:40, , 17F
恩恩~但是那層霧霧的測出來濃度3000多~難道不會是DNA嗎?
08/12 00:40, 17F
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08/12 00:42, , 18F
protocal我有~但是我怕不小心就把DNA去掉~不過還是謝謝!!
08/12 00:42, 18F
推
08/12 01:24, , 19F
推用60度C的TE BUFFER溶DNA~~效果應該比較好~~
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若擔心無法全溶~~可以分兩次溶解阿~~到時在濃縮就好了
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08/12 01:27, , 21F
我比較擔心的是那個沉澱物搞不好是變性的蛋白or其它雜質
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推
08/12 08:35, , 22F
出現兩個peak不太正常吧 不過要做PCR應該還是可以做..
08/12 08:35, 22F
推
08/12 12:34, , 23F
你的peak是不是有出現在280nm? 有的話應該是蛋白質沒去
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乾淨導致的 另外測濃度之前可以先vortex5秒 確定有均勻
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另外 之後如果還是結果不好 下一次抽的時候可在溶pellet
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時 以65度熱水浴1小時 促進溶解
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08/12 14:56, , 27F
有出現在280~今天重測也是兩個peak在230及280那~A260/280
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08/12 14:57, , 28F
為1.3~1.8左右~不知道怎麼每次測出來都會不太一樣...濃度
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08/12 14:58, , 29F
從70~100多都有..(同一管)雖然這樣但還是先拿去做long-PCR
08/12 14:58, 29F
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08/12 14:59, , 30F
跟Real-time了~不知道做不做得出來~現在只能試試看!
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08/12 14:59, , 31F
根據我家助理說的~他絕得有可能有混雜protein~
08/12 14:59, 31F
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08/12 15:01, , 32F
謝謝熱心的大大回答~只能等PCR跑完再說了..希望不會白做工
08/12 15:01, 32F
推
08/16 16:06, , 33F
請問你的sample是什麼?cell還是tissue?有的tissue會有
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08/16 16:07, , 34F
這樣的情形發生喔~你也可以是是把sample的量放少點
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08/16 16:08, , 35F
我的也之前是這樣阿...囧
08/16 16:08, 35F
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08/18 23:52, , 36F
是cell的~不過問題已經解決了^^溶不掉的是protein跟雜質
08/18 23:52, 36F
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11/11 01:40, , 37F
沒有什麼問題...改T https://muxiv.com
11/11 01:40, 37F
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01/03 16:59, 5年前 , 38F
為1.3~1.8左右~ https://noxiv.com
01/03 16:59, 38F
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