[求救] PCR primer 設計

看板Biotech作者 (一起企都都轟阿)時間16年前 (2009/05/29 17:52), 編輯推噓9(9推 0噓 10→)
留言19則, 8人參與, 7年前最新討論串1/1
請問各位先進 小弟遇到了一個問題 排除掉操作上的錯誤以外，個人認為似乎是primer設計上錯了... 我所使用的RE是NdeI(NEB) & XhoI (Roche)，buffer是Roche的Buffer H 再切Vector的時候都沒什麼問題，切Insert(PCR product)也看不出來有什麼問題。 只是ligation一直失敗，完全沒接進去。 後來曾經在板上查到說PCR primer上RE site外的EXTENSION sequence的部份要注意 小弟這邊是都設計四個Mer "ATAT"去給RE binding 不過在NEB的網頁中查到的資料 Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector) http://0rz.tw/gcIFJ Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) http://0rz.tw/0f2em 這兩個網頁不知道差在哪邊?? 似乎NdeI 需要7個Mer以上去給NdeI binding 不知道這樣推論對不對呢?? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.136.49.221 ※ 編輯: FUSION87 來自: 220.136.49.221 (05/29 17:52)
推
05/29 17:55, , 1F
如果方便的話做個TA cloning吧
05/29 17:55, 1F
推
05/29 20:11, , 2F
推TA cloning不會多花多少時間 比你卡在那裡好
05/29 20:11, 2F
推
05/29 22:25, , 3F
第2個連結是 中華武術?
05/29 22:25, 3F
推
05/29 23:53, , 4F
摔跤協會
05/29 23:53, 4F
抱歉 以改正 縮網址的時候打錯
推
05/30 00:20, , 5F
既然您說切的時候沒問題，為啥又要看這個幾個mer的東西呢
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05/30 00:22, , 6F
vector先切一刀，再CIP，再切另一刀，再CIP，這樣再去接
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我的意思是說 切vector都沒什麼問題，有看到片段掉下來 不過pcr product就切的前後想說只掉幾個mer，也看不出個所以然來... ※ 編輯: FUSION87 來自: 220.136.65.227 (05/30 00:55)
推
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這樣的話接TA之後也是會遇到同樣的問題，好像沒有比較好
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推
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不對，我想錯了，接上TA後，RE就有很多mer可以黏上去
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這樣理論上就切的動了
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推
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你有做CIP嗎 之前用HindIII設計忘記加flanking還是成功
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ligation的時後多加個vector當control
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比較colony數就大概知道有沒有切成功了
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打錯 多加個vector alone
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推
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我也覺得關鍵是CIP
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有做CIAP 不過其實還是會有self ligation的狀況出現..
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如果使用commercial competent cells的話 就一顆都不長..
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感謝 最後用TA接完了^^
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11/11 01:30, , 18F
ligation的時後 https://muxiv.com
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01/03 16:55, 7年前 , 19F
推TA cloning https://noxiv.com
01/03 16:55, 19F
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