[求救] 用ＰＣＲ求得一段未知片段 其結果皆為s …
如題
genomic DNA濃度為0.08ug/ul 取250ul
1.一開始先用restriction enzyme處理 genomic DNA後，蒐集感興趣的片段（約2kb）
做phenol/chloroform處理後，用12ul 二次水回溶，用全部體積下去做self-ligation，
overnight。
2. DNA（ligation 產物）
10X PCR buffer 1X
Primer 1 0.2uM
Primer 2 0.2uM
Taq 2U
Dntp 0.2mM
二次水
Total 20ul
Primer Tm值為51℃，長度皆為20mer，無GC-rich。
PCR condition：
1. 94 2min
2. 51 2min
3. 72 2min
4. 94 1min
5. 51 1min
6. 72 2min
7. 30cycles
8. 72 5min
此次PCR結果為product 1，取部份product 1做第二次PCR，之後使用另外一組primer
（Primer Tm值為51℃，長度皆為20mer，無GC-rich），同樣的condition，其PCR結
果為product 2
3.跑0.8％ gel（有negative control）
結果：
negative control為預期結果
product 1 smear
product 2 smear
我想要的是一個band啊> <
請問有何解決之道
--
-----------------------------------------------------------------------------
是誰在... ▃▄▄▄ 哀家的 |\\ // | ◣ \\ //
▃ ▄ 通路上..| ﹨┌ / | ◥ 小海豹！ //
◢ ◣ ◣ ◢ | █┘ ◢◤ | ◣ ◤◣/
◢█ ◣◤ ∥◥ ﹒ ﹒ ▄ ◢ | ▃ ◢ ◥ | ◥◣◢ ◣
∠ █ ＝┌˙ ▄ | / ★◥ ◤ | ◤ ◥▊★" ◣ \
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.208.24.95
※ 編輯: wind90257 來自: 134.208.24.95 (05/27 14:46)
推
05/27 21:22, , 1F
05/27 21:22, 1F
→
05/27 21:23, , 2F
05/27 21:23, 2F
推
05/31 14:40, , 3F
05/31 14:40, 3F
→
05/31 14:41, , 4F
05/31 14:41, 4F