[求救] 有關Western Blotting(附圖)

看板Biotech作者 (陳小文)時間16年前 (2009/05/05 19:08), 編輯推噓10(10推 0噓 19→)
留言29則, 9人參與, 7年前最新討論串1/1
最近每天都在作Western Blotting 發現有時會出現一些問題 圖在 http://0rz.tw/C0ZS3 有問題的地方用紅色圈圈起來 每次壓片後，發現總是有某些地方都是空白 我們有用Magic Marker，連Marker壓出來也都怪怪的 補上實驗步驟 1. 7.5% or 10% SDS-PAGE 2. Sample與sample buffer比例1：1的混合 3. 混合後置於乾浴機105℃-110℃中10分鐘，再置於冰上冷卻 4. 以65V進行電泳，直到tracking dye跑至膠體底部 5. 將SDS PAGE取出，裁切適當大小後，置於Gel buffer中10-15分鐘(100 rpm)、NC mambrane置於ddH2O、3M paper置於blottting buffer潤濕 6. 半乾濕（Bio-Rad）Transfer 18V 1小時：a.3M paper b.PVDF c.SDS-PAGE d.3M paper 7. Transfer後，將mambrane置於blocking buffer中室溫1小時 8. 以Washing buffer washing mambrane 3次，每次5分鐘 9. 一級抗體在4℃ o/n 10.利用Washing buffer清洗mambrane 3次，每次10分鐘 11.二級抗體在室溫1小時 12.利用Washing buffer清洗mambrane 5次，每次3分鐘 13.混合Substrate（Millipore）進行壓片 麻煩請大家幫我看看是哪邊出問題！謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.22.9 ※ 編輯: sjacky 來自: 61.64.22.9 (05/05 19:08)
推
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有空氣嗎?
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沒有耶，有氣泡頂多也是小點點，不太可能一大塊 ＠＠
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我也重複趕過很多次，基本上，不太可能有氣泡
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※ 編輯: sjacky 來自: 61.64.22.9 (05/05 19:34)
推
05/05 19:35, , 4F
ECL在membrance上加一點再蓋起來試試看
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我加入的ECL共400ul，足以完全覆蓋mambrane，並作用30秒後
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才壓片
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我也都有重複壓片，並延長時間，結果都差不多 >"<
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推
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transfer的問題XD 而且你缺的都是在右下角
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另一片是在右上 不過我覺得是擺的位置不同差異
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跟別人借transfer機器看看
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嗯，我們討論也是猜測transfer出問題，不過也有別人用同樣
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的機器，但是他做出來的就很漂亮，機器沒有異常
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莫非是我手殘......
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推
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下次你transfer完後把膠拿去染看看
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明天打算染膠和染壓片後的mambrane，在看看結果如何
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不知道蛋白殘留在mambrane和轉過去mambrane有多少蛋白
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推
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是NC還是PVDF
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05/05 22:25, , 18F
NC
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推
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我懷疑是transfer夾子鬆掉, 可以多墊張海棉~~
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推
05/06 01:48, , 20F
你不適合用semi-dry, 換用濕式的吧..
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推
05/06 02:53, , 21F
沒看到 原來是用semi-dry喔 我眼殘 呵呵
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推
05/06 13:42, , 22F
Transfer的問題.把3M紙上下都加到4張.疊好之後,用剪短的
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的pippet在上頭輕輕滾動,壓跑氣泡順便把所有東西略為壓緊,
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並確定transfer的電極板有放好.然後blocking和probe的過程,要
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確定溶液有泡得很均勻.這樣子應該就不會空白的地方了
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嗯，我今天transfer的時候，有特別注意，明天做完看看結果
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推
05/07 01:33, , 27F
加油 等你的好消息 這樣也可以增加經驗勒
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11/11 01:27, , 28F
明天打算染膠和染壓片後 https://noxiv.com
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01/03 16:54, 7年前 , 29F
你不適合用semi-d https://daxiv.com
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