[求救] 大片段的ligation !?
我所使用的載體是pcDNA3 (invitrogen)
其實片段說大也不是很大 想要ligation的片段大小大約1000 bp而已
但是這個載體我之前有先接上另一個基因，基因片段是2200 bp左右
所以使得原本5.4 kbp的pcDNA3載體大小變成了7600 bp
現在的實驗就是想要把這1000 bp的基因ligation到這7600 bp的載體中
最後預計產生的載體大小將近10 kbp
我用的RE site是EcoRV (NEB)，會產生平端的切位
切完的vector有使用Antarctic phosphatase移除磷酸根
RE使用的DNA量為 5 ug
截切 overnight
截切後切膠純化，並測定回收後的DNA濃度
ligation所使用的DNA總量為100 ng
分三個不同insert vector比 1:1 3:1 7:1
ligation用的水是DEPC水
ligation的條件有使用 常溫2hrs (protocol建議平端ligation條件)
4度 overnight
16度 overnight
經過transform JM109後，完全沒有colony產生 囧"
compontent cell 測試是OK的
想請問我還可以在哪些步驟修改方法的
想順便請問pcDNA3最大可以接受多少的insert
有在考慮是不是因為insert太大做不出來，或是ligation後的vector太大不好transform
麻煩大家了 orzzz
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◆ From: 140.112.59.235
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