[求救]transformation不進去?

看板Biotech作者 (火球連發~)時間16年前 (2009/05/01 09:36), 編輯推噓9(9推 0噓 22→)
留言31則, 9人參與, 7年前最新討論串1/1
我要送一個質體大小是7.5kb+0.2kb 切位是ClaI and BamHI 載體(7.5kb)截切6小時以上後 有做CIP處理切膠純化 insert(0.2kb)是PCR產物在primer上設計切位 截切1小時切膠純化 16度ligase overnight後 使用YE607勝任細胞做轉殖 先冰15分鐘 42度45秒 再冰15分鐘後塗PLATE 但幾乎都沒有colone產生 不然就是長出來的是原始的載体? 請問是轉殖效率太低 改用YE609 ? 或是質體沒接上的關西? 做了10幾次了>"<... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.109
推
05/01 09:47, , 1F
heat shock完，一般不是37度recovery 30-6o mins?
05/01 09:47, 1F
→
05/01 09:49, , 2F
200b.p的片段，純化要小心column是否有辦法有效留住
05/01 09:49, 2F
→
05/01 09:52, , 3F
我是照他的protocal做的 純化我使用kit也有跑膠確認
05/01 09:52, 3F
→
05/01 09:53, , 4F
應該有留住band很濃
05/01 09:53, 4F
推
05/01 09:53, , 5F
你沒有recovery...除非你的comptent cell效率超高..
05/01 09:53, 5F
→
05/01 09:54, , 6F
要不然這樣大多都不會太好...
05/01 09:54, 6F
→
05/01 09:54, , 7F
唯一用過不recovery的就是跟廠商買的那種超高效率的XD
05/01 09:54, 7F
→
05/01 09:54, , 8F
好 我試看看 謝謝!
05/01 09:54, 8F
→
05/01 09:55, , 9F
我的是跟廠商買的耶...不過是經濟型的 會差很多嗎?
05/01 09:55, 9F
→
05/01 09:55, , 10F
heat shock完 加入一些LB medium 放37度一小時
05/01 09:55, 10F
→
05/01 09:56, , 11F
我跟廠商買的那種是..室溫vortex 1秒就能轉成功的歐XD
05/01 09:56, 11F
→
05/01 09:58, , 12F
那還真強 是益生的嗎?
05/01 09:58, 12F
推
05/01 09:59, , 13F
忘了= =...好久以前了 後來都自己做
05/01 09:59, 13F
→
05/01 10:07, , 14F
恩謝謝~ 以前送比較小的質體都很好送 現在這比較大的都
05/01 10:07, 14F
→
05/01 10:07, , 15F
很難接 都做10幾次才能接上>"<
05/01 10:07, 15F
推
05/01 10:23, , 16F
我剛學做clone用的是十幾Kb的 = = 做了半年才送進去
05/01 10:23, 16F
→
05/01 10:26, , 17F
@@~~你的勝任細胞是買的嗎? 半年..我也接一年了
05/01 10:26, 17F
→
05/01 10:27, , 18F
做完的要送到Aspergillus niger還轉不進去
05/01 10:27, 18F
推
05/01 11:22, , 19F
我是接學姐的繼續做 所以加起來也是一年= = 最後沒表現
05/01 11:22, 19F
推
05/01 12:20, , 20F
primer酵素切點左右有預留幾個mer吧？heat shock完冰15分會
05/01 12:20, 20F
→
05/01 12:20, , 21F
不會太久阿...我只冰2分鐘而已耶
05/01 12:20, 21F
→
05/01 12:20, , 22F
冰完加LB養30分鐘以上
05/01 12:20, 22F
→
05/01 12:44, , 23F
primer旁邊有加4個mer 冰的時間有關係喔?
05/01 12:44, 23F
推
05/01 14:44, , 24F
NEB舊的catalog有說限制酵素切點外要多加2-3mer，並切>16h
05/01 14:44, 24F
→
05/01 14:48, , 25F
才有>90% efficiency，再加上你的colony都是vector only，
05/01 14:48, 25F
→
05/01 14:48, , 26F
極度有可能是insert沒切好，接不進去。Try it!
05/01 14:48, 26F
推
05/01 23:58, , 27F
insert沒切好,或是切壞了
05/01 23:58, 27F
推
05/02 13:51, , 28F
RE的end-cutting最好確認一下, 另外, 我是heat shock完
05/02 13:51, 28F
→
05/02 13:52, , 29F
冰5分鐘, 然後加LB 37度搖50分鐘
05/02 13:52, 29F
→
11/11 01:26, , 30F
冰5分鐘, 然後加LB https://muxiv.com
11/11 01:26, 30F
→
01/03 16:54, 7年前 , 31F
primer旁邊有加4 https://muxiv.com
01/03 16:54, 31F
‣ 更多 relaxsleep 的文章
文章代碼(AID): #19-b8TPx (Biotech)