預測RE切點與實際結果不符合

看板Biotech作者 (hicage)時間17年前 (2009/04/28 14:07), 編輯推噓3(3推 0噓 6→)
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想要請教板上大大, 不知道各位有沒有這樣的經驗, 小妹我用<BstAPI>切targeting vector, 依照NEB預測切點軟體, 理論上應該會看見 2+13 kb的兩個band, 但是結果總是跑出異常的pattern, 與未切的targeting vector比較, BstAPI的確有作用, 因為pattern與vector不同, 但是卻不是預測的 2+13 kb的兩個band, digestion condition完全依這NEB的建議, Buffer4, 10xBSA, incubate @ 60度 total DNA ~0.5ug 我試過digestion 1, 2,或 3 hrs, pattern略有不同, 但是都不正確, 爬文有發現某些enzyme site有甲基化的問題, 但是我的結果似乎不像是enzyme 切不動, 希望有類似經驗的大大可以分享一下經驗!!謝謝!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 75.72.179.213
推
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有圖嗎...?
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推
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來張圖會比較清楚一點
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建議0.2ug in 20ul total volume，不用BSA，0.5ul enzyme
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大於1/20的enzyme，裡面所含的glycerol會影響反應
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謝謝大家的建議, 我會試著把圖補上
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推
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另外，用別的酵素試試看看是vector還是BstAPI的問題
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vector定序過了,理論上沒有問題,(當然小機率可能出錯)
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因為定序沒有辦法讀到BstAPI site
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04/28 15:17, , 9F
我用過AscI確認,band的size是正確的
04/28 15:17, 9F
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