關於Western
最近做 IP 和 Western 分別出現一些問題想提出來請教一下大家。
主要是要偵測 接 HA 的 A protein 和 接 Myc 的 B Protein是否有interaction。
所以在做 IP 時 用 HA-agarose (Sigma)， Western 則測 anti-Myc-HRP（Roche）。
結果每次只要是 IP 過後的 Sample，一抗 Anti-Myc-HRP，之後 Detection
都會呈現整片發光的情形（呈色使用的是 Millipore Immobilon）。
若使用 anti-HA-HRP 的抗體則不會。
另外，在做非 IP 的 Sample 時，Anti-Myc-HRP 的雜Band和背景會很強，
但不至於整片黑。
還有一個問題是，是關於牛奶的濃度。
本實驗室向來用 1% Non-Fat Milk 做 blocking、1 抗、2 抗。
有一次新買了一個抗體 Monoclonal Anti-c-Myc (Sigma)，
廠商建議是： 5% Non-Fat Milk； 抗體 1:5000 稀釋，室溫 1-2 小時。
第一次使用時 我用 1% Non-Fat Milk； 抗體 1:7000 稀釋， 4℃，O/N。
有偵測到 Band（還算強）。
第二次使用時，我想說廠商建議是 5% Non-Fat Milk，那我用 3% 試試看。
所以是 3% Non-Fat Milk； 抗體 1:7000 稀釋， 4℃，O/N。
結果什麼都沒有（有一片壓很久只出現一個 Band）。
唯一改變的是牛奶的濃度，但是我還是比廠商建議的來的低，應該不至於
Overblocking 吧。
不知道大家怎麼看？歡迎提出來討論，謝謝。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
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