[求救] 用Ficoll-Hypaque分離PBMC的問題~~求救!!

看板Biotech作者iris416 (Mei-Mei)時間15年前 (2009/04/11 00:42)推噓6(6推 0噓 26→)

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又來這邊跟大家討論一個問題了~ 今天幫學姊做抽取PBMC加入TRIzol以後抽DNA跟RNA的實驗不過遇到一個我覺得滿嚴重的問題想向版上高手討論到底發生什麼事情了我們用的sample是醫院JRA病人的全血~ 去除血漿將血液用HBSS稀釋~ 再用"Ficoll-Hypaque"去分層~ (這一步分層都做得很明顯,所以應該不是這一步的問題) 離心以後傻眼的事情發生了........... 就是原本用Ficoll分層從上到下應該依序是 plasma=>monocell(理論上應該是很明顯的白色)=>Ficoll-Hypaque=>血球這四層但是很奇怪,我們離心完的monocell這層居然是紅色的!!!!!!(應該是血球跑上來) 以下有圖,我特地照下來放~ http://www.wretch.cc/album/show.php?i=irishappy416&b=14&f=1220235279&p=0 http://www.wretch.cc/album/show.php?i=irishappy416&b=14&f=1220235280&p=1 http://www.wretch.cc/album/show.php?i=irishappy416&b=14&f=1220235281&p=2 那層紅紅的就是! 之前我也抽過,但不曾發生這種情形爬文看看版之前也有人問過類似的問題回答是可能血液不新鮮或者病人抽血前有吃東西之類的...不知道有沒有可能?? 還有一個可能就是在這步離心的時候是"不能有煞車"的但好像實驗室有其他學長及著要用還是幹嘛,可能有先按掉離心機停止= =@@ (但他是跟我說沒有...所以想說誤會人家就不好了..) 再離第二次的結果還是這樣!!!(那或許是我誤會人家了...@@) 真的很奇怪~找過其他的學長討論...該不該就把那層抽起來,再用HBSS洗乾淨 (學長是告訴我要PBMC的話有紅血球是多少會有干擾@@) 但是好像效果不大....我洗了三次(protocal寫兩次...) 雖然有pellet,但是我都搞不清楚那到底是pellet還是紅血球了... (因為一整個紅紅的,正常的pellet並不會那麼紅) 要再用HBSS洗第二次要打散細胞的時候,整著呈現蕃茄般的紅色.. (正常應該是濁濁的淡黃色) 最後加入TRIzol保存的時候,本來應該是要整個粉紅色裡面有白白的pellet在飄但是它都變成玫瑰紅,也是有東西在飄...但是是偏紅色的>< 我想問到底哪裡出了問題&這樣到底會不會抽到PBMC?如果有抽到真的可以用嗎? 這真的很重要~因為是病人抽血而來珍貴的樣材, 我想到就這樣浪費了真的很不好! 而且我們也是在接計畫的應該對每一位病人送來的血負責任... 而且也對實驗室的大家感到抱歉... 欸這麼簡單的實驗都沒有做好>"< 我也在看著protocal反覆思考自己哪裡做錯了. 真的沒有... 因為做了好多次了(雖然旁邊有學姐帶)算很熟但這次學姐不在竟然沒有弄好... 好想知道哪裡出了問題...可以給學姊們一個交代@@ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.58.189.176

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