[求救] 要在target上接一個retriction site

看板Biotech作者 (笨蛋TACO)時間17年前 (2009/02/11 00:18), 編輯推噓4(4推 0噓 5→)
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因為作clone的需要 所以我要在target序列的前面多加一個限制脢切位 我想到的作法是 因為模板是genomic DNA所以 我的forward primer可以設計成如以下 ATG以後是target 5'-.....ACTTGG ACCGCT ATGGGGCC.....-3' 假設我要加進去的site為TAGGAA primer=>acttgg TAGGAA atggggcc 如此做pcr把site接進去 那我想問的是 我是否可以先設計跟原始序列相同的primer把target先p出來 再用加了切位的primer做secondary PCR 如以下 target序列 5'-ATGGGGCC....-3' forward primer=> TAGGAAatggggcc.... 這樣p是否能將切位加上去 或者不行 麻煩大大們解答一下 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.112.6.180
推
02/11 02:17, , 1F
我的經驗是可以,但是應該可以直接就使用 新的primer去夾
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genomic DNA 就好了
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推
02/11 02:23, , 3F
用 acttggTAGGAAATGGGGGCC 這條夾就好了。PCR後純化可立刻切
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推
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同上兩位 為什麼要多此一舉呢？不是很懂你的用意
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02/11 09:36, , 5F
因為個人另外想如果模板是cDNA的話 是否可以用第二種
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方法XD 感謝大家嚕
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推
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你的第二條primer有5個mer和原始序列不同, 算多了, 分
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兩階段夾比較不會夾出太多的雜訊, 另外要用cDNA或者
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genomic DNA 要看你要夾的地方有沒有 intron 來決定
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