Western blot的Marker會被抗體辨識？

看板Biotech作者 (無心交代)時間17年前 (2009/02/07 21:09), 編輯推噓2(2推 0噓 5→)
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最近跑Western 使用mouse anti GFP做為一抗，室溫O/N(1:20000) anti mouse HRP conjugate做為二抗(1:5000)，室溫一小時 壓片顯影一個半小時後，發現Marker會出現band，此外wild type negative control 在目標位置以外也會出現訊號，比實驗組預期位置的訊號還要明顯 請問這些不預期出現的訊號是因為我的二抗下太多嗎 或是blocking不夠？洗得不夠乾淨？(實驗時皆使用TSW進行blocking，稀釋抗體，wash) 另外，若要壓片久一些，該特別注意先前的哪個步驟？ 謝謝各位指教！！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.113.199.106
推
02/07 22:09, , 1F
在室溫一抗通常2~3hrs即可,且室溫probe background會高
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02/07 22:11, , 2F
我通常一抗都4度O/N或室溫hrs耶!建議做一個mouse IgG
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02/07 22:11, , 3F
為一抗的control,這樣比較可以確定你要看的band
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02/07 22:12, , 4F
我第二行漏打了...囧rz~是室溫2hrs
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推
02/07 22:27, , 5F
我一抗都室溫1 hr而已,因為我一抗有reuse
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02/08 15:40, , 6F
謝謝兩位指教:)因為protein量少，所以才會以一抗O/N來試，我
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02/08 15:42, , 7F
會再試試看一抗的條件，thx~~
02/08 15:42, 7F
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