[求救] TRIzol抽RNA時 想要去除DNA

看板Biotech作者 (XareeLee)時間17年前 (2009/01/19 21:13), 編輯推噓10(10推 0噓 10→)
留言20則, 9人參與, 7年前最新討論串1/1
以前有用TRIzol抽過RNA 都是酒精沈澱回溶後 測完OD才加入DNase I 可是最近想要簡化流程（省時間並減少RNA損失） 又想要確保沒有DNA殘留 不知道下面步驟能不能使用？ 請大家看看提供一下意見？ 1.將菌液離心後，使菌塊溶解於TRIzol(1 mL)當中，充分均質並放置15 min 2.加入chloroform(0.2 mL)後，混合均勻並放置5 min 3.離心後小心吸取上層的上清液（約540 uL) 4.加入DNase I(量可能要抓） <====新增步驟 5.重新phenol/chloroform和離心取上清去除protein <====新增步驟 6.isopropanol沈澱RNA，離心取得RNA pellet 7.用75% ethanol清洗，離心後乾燥RNA pellet 8.回溶於DEPC-treated water，測OD260&280 9.RNA gel確定RNA品質，同時進行RT取得cDNA進行保存。 這樣應該可以確保沒有gDNA殘留，並且可以加快實驗步驟 這樣可行嘛？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.13 ※ 編輯: xareelee 來自: 140.129.77.13 (01/19 21:14)
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嗯，看樣子，你們 Lab 應該挺有錢的。DNase，我們一般不在那
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時候加......
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恩~這樣做應該要加比原本多快10倍的DNase量吧
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你第四步DNAse就死光啦,怎麼去的掉
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DNase:幹！
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樓上...囧...
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1>2>3>6>7>8+確認品質>4>再測一次OD>合成cDNA
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DNase用量請參考說明書 一定量的sample+一定量的DNase
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我也是抽植物 用量在0.5~1 micro-g之間
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還有 不見得每次都要用DNase 你可以跑個PCR檢查一下有無
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genomic DNA殘留 因為若要microarry的就不能加DNase
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又打錯字....microarray囧
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第3步犧牲一些 不要抽太靠近分層的地方就OK
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依照我們實驗室的protocol 第三步的時候 只取400ul
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而且在取的時候 盡量不要吸到中間的白色沈澱物
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所以說 正常的TRIzol抽取 不會有genomic DNA殘留囉？
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加氯仿離完新以後要避免晃到 這樣水層應該不會有DNA
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不是不會留有 DNA 殘留，而是其量可以減少很多很多。
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DNase用量請參考說 https://muxiv.com
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01/03 16:50, 7年前 , 20F
DNase用量請參考說 https://noxiv.com
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