[求救] PCR P大片段一直失敗

看板Biotech作者 (蛙哈哈)時間17年前 (2008/11/19 15:56), 編輯推噓6(6推 0噓 17→)
留言23則, 7人參與, 7年前最新討論串1/1
DNA template是plasmid上的一段insert (有頭尾定序過) RE cutting site和之後要乘載的vector不能配合 所以設計成兩端翹尾巴 含有RE cutting site的primer 用來夾cDNA Forward: AAT TTA GGA TCC ATT ATG GAG GGC GCC GGC GGC GC Tm:72 GC%:60 Reverse: TAA ATT GGA TCC TCA TCA GTT AAC TTG ATC CAA AG Tm:62 GC%:34.29 Primer設計在這個基因的ATG與TGA附近 與cDNA互補的序列 是照抄定序結果(與data base查到的相同) 命中注定 一堆GC...... 另一條卻沒有太多GC Forward primer的部分也沒辦法改 這個gene的ATG前面 居然有個TGA 不把這個TGA弄掉的話 後續我要做C-terminal的Flag fusion就甭做了 @@ 於是在這個詭異的條件下 我還是拿去跑PCR 第一次: 95度10min [95度30sec 55度30sec 72度1min]x25 72度10min 25度收尾 結果 一片空白 只有看到vector的band taq: invitrogen買的 第二次: 95度10min [95度1min 55度1min 72度1min]x25 72度10min 25度收尾 結果 只看到100 bp底下有一團霧霧的 只看見Vector的band taq: invitrogen買的 或者 Promega買的Gotaq master mix 第三次: 95度10min [95度1min 50度1min 72度3.5min]x25 72度10min 25度收尾 還另外多做一管 有加DMSO (1 ul in 25 ul) 結果 在沒有加DMSO這組 多出一條400 bp的band 只有Invitrogen這牌有做出 taq: invitrogen買的 或者 Promega買的Gotaq master mix 我的PCR product size應該有2.5 Kb 但是卻總看不到一點點產物 希望有處理過類似情況的人 幫我想想辦法 有缺列出的condition 我會隨時來看推文 並且補上資訊 有任何建議 我都會去做做看 死馬當活馬醫 先謝謝大家的幫忙 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.60.214 ※ 編輯: hawksbill 來自: 140.116.60.214 (11/19 16:02)
推
11/19 16:33, , 1F
95度 30 sec 60度 30 sec 72度2.5min]x30~35 試試看
11/19 16:33, 1F
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11/19 16:34, , 2F
另外要表現的話還是建議用Pfu來PCR,Taq還是會有錯
11/19 16:34, 2F
推
11/19 16:37, , 3F
忘了說你vector好像加太多,200~500 ng即可
11/19 16:37, 3F
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11/19 19:21, , 4F
謝謝 等等來跑跑看
11/19 19:21, 4F
推
11/19 21:13, , 5F
Pfu的話我用過P大約5K的片段 P不出來...> <
11/19 21:13, 5F
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11/19 21:13, , 6F
但是我用Long PCR taq就可以成功p出來而且沒有錯誤
11/19 21:13, 6F
推
11/19 21:18, , 7F
forward primer 非常容易形成dimer哦
11/19 21:18, 7F
推
11/19 21:20, , 8F
需要proof reading又要做長片段，用Phusion比較合適。
11/19 21:20, 8F
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11/19 21:37, , 9F
先拿其中一組建議的再測試中 謝謝大家的建議
11/19 21:37, 9F
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11/19 21:38, , 10F
死馬當活馬醫了 天曉得這個Gene幹嘛一堆GC.......
11/19 21:38, 10F
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11/19 21:38, , 11F
手邊借的到的polymerase如果都失敗 再去買高級品 ^^a
11/19 21:38, 11F
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11/20 06:36, , 12F
回報消息 感謝鄉民們的建議 我用了touchdown PCR的方法
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目前至少有做出正確大小的片段了 繼續往下一步邁進
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11/20 06:36, , 14F
感謝大家... 以後又卡關的話 再來問 ^^
11/20 06:36, 14F
推
11/21 23:58, , 15F
可以借問一下~那touchdown請問你設怎樣阿~我跟原PO有類似
11/21 23:58, 15F
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11/21 23:59, , 16F
的問題,一樣forward 有一堆GC, 可以借我參考一下嗎~3Q
11/21 23:59, 16F
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11/22 05:28, , 17F
94 2min --> 94 30sec 72 1min (5 cycle)-->
11/22 05:28, 17F
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11/22 05:28, , 18F
94 30s 70 1min (5 cycle)-->
11/22 05:28, 18F
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11/22 05:28, , 19F
94 30s 50 1min 72 1min (25 cycle)
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11/22 05:29, , 20F
-> 72 10min --> 25 forever
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11/22 05:29, , 21F
這是好心人建議我的參數 有做出來 ^^
11/22 05:29, 21F
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11/11 01:09, , 22F
這是好心人建議我的參數 https://muxiv.com
11/11 01:09, 22F
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01/03 16:48, 7年前 , 23F
手邊借的到的polym https://muxiv.com
01/03 16:48, 23F
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