[討論] 基因選殖問題?

看板Biotech作者 (chi)時間17年前 (2008/11/05 18:17), 編輯推噓2(204)
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我要表現一段大約3kb大小的cDNA序列,可是這一段序列量不足,需重新量化 ,但是這一段cDNA並無放進plasmid,然而僅有5'端及3'端以及中間部份序列有 被放進plasmid中,這三段序列兩兩有重疊部分.我再想是否可先將這三段序列 量化出來,接著再利用pcr方式將此三段合成一段在以此當template來量化出我 要的全長cDNA序列.不知此方法可行嗎? 3kb ├────────────┤ 5端部份序列 ├─────┤ 中間部分序列 ├──────┤ 3端部份序列 ├────────┤ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.121.155.210

11/05 18:56, , 1F
三段PCR產物, 可以接成一段. 只要最外側的primers.
11/05 18:56, 1F

11/05 18:57, , 2F
PCR產物最好純化過, 再進行下一個PCR反應.
11/05 18:57, 2F

11/05 18:58, , 3F
重疊的部份, 最好超過20bp以上, PCR比較容易成功.
11/05 18:58, 3F

11/05 18:59, , 4F
困難度一定有,要有失敗的心理準備. 接成一段,可以省時.
11/05 18:59, 4F

11/05 19:01, , 5F
也可以先試A+B or B+C 的PCR, 評估兩股PCR的成功率..
11/05 19:01, 5F

11/05 22:11, , 6F
如果有cDNA,應該可以直接將整段P出來吧...?
11/05 22:11, 6F
文章代碼(AID): #194NB0xd (Biotech)