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看板Biotech作者 (表面的和平)時間17年前 (2008/10/24 01:22), 編輯推噓9(9推 0噓 19→)
留言28則, 10人參與, 7年前最新討論串1/1
常見ligation是16度C overnight 不知道有沒有人做過室溫的ligation 我自己有做過室溫15min的ligation 不過因為得到的clone數太多 老師覺得很不真實 覺得室溫ligation15min的方法非正統 得到的結果需要被質疑真實性 我們家用的是invitrogen的T4 DNA ligase 有人也有用過這樣的方法去做ligation嗎 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.171.87.15
推
10/24 01:25, , 1F
我比較常做4度c overnight...效果挺好的XD
10/24 01:25, 1F
推
10/24 01:28, , 2F
室溫15min我也覺得有點快~如果要快我們會放37度1hr~但大部
10/24 01:28, 2F
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10/24 01:29, , 3F
份都像一樓~~放4度C overnight
10/24 01:29, 3F
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10/24 01:31, , 4F
對了~你的室溫15min 每個clone都有接進去嗎!? 有點好奇~
10/24 01:31, 4F
推
10/24 03:05, , 5F
我們做TA都是25度1hr 一般的clone這樣做也都有出來
10/24 03:05, 5F
推
10/24 09:27, , 6F
NEB T4 ligase,室溫一小時,結果OK.
10/24 09:27, 6F
推
10/24 09:41, , 7F
有東西出來比較重要吧.現在那個技術不是講求節省時間
10/24 09:41, 7F
推
10/24 12:33, , 8F
之前趕時間的話,室溫下 3-4 hr 就transformation了,沒問題
10/24 12:33, 8F
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10/24 14:39, , 9F
酵素一到不都會有標準使用程序嗎?怕不準不是可以做對照組?
10/24 14:39, 9F
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10/24 14:40, , 10F
就一組接insert一組接D2水,或是藍白篩,抗生素篩,一翻兩瞪眼
10/24 14:40, 10F
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10/24 14:40, , 11F
把結果攤給你老板看不就知道有沒有可信度...
10/24 14:40, 11F
推
10/24 18:52, , 12F
切完的vector alone也要一起ligation和塗plate做control
10/24 18:52, 12F
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10/25 18:59, , 13F
我有做過2次室溫15min的 第一次忘記挑幾顆(要翻記錄本)
10/25 18:59, 13F
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10/25 19:00, , 14F
但至少挑到了有8成有接進去
10/25 19:00, 14F
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10/25 19:01, , 15F
第二次挑10顆有9顆有接進去
10/25 19:01, 15F
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10/25 19:02, , 16F
雖然兩次我都有另外做一組 16度C overnight的
10/25 19:02, 16F
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10/25 19:02, , 17F
但是挑到我要的就沒有再從16度C的那組下去挑clone
10/25 19:02, 17F
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10/25 19:04, , 18F
我有送sequence 先證明這次的clone是正確的
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10/25 19:06, , 19F
這幾天會做實驗對照比較
10/25 19:06, 19F
推
10/25 19:48, , 20F
應該不用到定序,就對照跟實驗組抽完plasmid用酵素切一刀
10/25 19:48, 20F
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10/25 19:49, , 21F
跑膠看長度就是一翻兩瞪眼了,除非你片段差異很小
10/25 19:49, 21F
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10/25 19:51, , 22F
而且要是plasmid沒接進去東西長度不會變,頂多接到不要的東西
10/25 19:51, 22F
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10/25 19:51, , 23F
接到不要的東西也是證明可以接東西進去,而不是接不進去
10/25 19:51, 23F
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10/25 19:53, , 24F
要是有空vector的話拿去切一刀也可以當對照組
10/25 19:53, 24F
推
10/25 22:46, , 25F
說實在的PCR跟RE check或者定序都正確的話，那就是對的
10/25 22:46, 25F
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10/25 22:47, , 26F
ligation的條件那麼多種，有東西最重要！
10/25 22:47, 26F
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11/11 01:05, , 27F
跑膠看長度就是一翻兩瞪 https://daxiv.com
11/11 01:05, 27F
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01/03 16:47, 7年前 , 28F
這幾天會做實驗對照比較 https://muxiv.com
01/03 16:47, 28F
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