[求救] 有關real-time PCR

看板Biotech作者 (懶的換暱稱!!)時間17年前 (2008/10/12 23:41), 編輯推噓5(5推 0噓 14→)
留言19則, 5人參與, 7年前最新討論串1/1
請問一下~ 關於Real-time PCR測得的copy number數 因為 我做的樣品濃度都很低 當copy number太低時 會導致Ct值都會約38-39才上升 而且 這時候都會三重複都有點誤差 之前有問過前人 她跟我說即使是做standard curve 也沒辦法做到這麼低的copy number 量太低時也都會"飄"掉(三重複有誤差) 所以 想請問一下 若我遇到這種情況 我應該就直接把Ct值大於38的直接忽略掉 當作沒測到嗎?@@ 可是 這樣也蠻奇怪的 因為我的Health是不會上升 若把Ct值大於37忽略掉 這樣感覺上有點怪 但若硬要說它有 卻得到的數據沒有那麼準確 (因為連standard curve最後也都不太準了) 請問 有人有好的建議或參考資料可以看嗎? 謝謝^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.62.92.63
推
10/12 23:46, , 1F
第一，你的樣品有稀釋嗎？若有記得別稀釋太多倍。
10/12 23:46, 1F
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10/12 23:47, , 2F
第二，試著將std cuv往後拉，若在37,38還有線性，就OK！
10/12 23:47, 2F
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10/13 00:23, , 3F
有稀釋 可是我還是把量設定在ABI跟我講的範圍內
10/13 00:23, 3F
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10/13 00:24, , 4F
因為 他們跟我說 template量太多 有時候反而會影響結果
10/13 00:24, 4F
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10/13 00:24, , 5F
所以 我就沒有改濃度
10/13 00:24, 5F
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10/13 00:25, , 6F
嗯嗯 我目前也是將standard curve往後啦 盡量測多點
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10/13 00:26, , 7F
所以 standard curve最多也只能測到Ct 37-38左右嗎
10/13 00:26, 7F
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10/13 00:27, , 8F
謝謝^^
10/13 00:27, 8F
推
10/13 00:36, , 9F
有用melting curve看過嗎 38 39有的時候是非特異性 要小心
10/13 00:36, 9F
推
10/13 00:59, , 10F
不過你目前是template不足，增加template量應該沒問題
10/13 00:59, 10F
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10/13 01:02, , 11F
若是擔心n-spc binding，檢查Mt就會知道了(primer決定...)
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10/13 01:05, , 12F
我也試過加倍primer(0.5uM→1uM)，有時會有幫助..抱歉縮寫
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10/13 01:32, , 13F
我做的是TAGMAN 抱歉 忘了說
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推
10/13 01:42, , 14F
啊...那抱歉了，我的是SYBR G的經驗....
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10/13 02:12, , 15F
沒關係@@ 還是謝謝你
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推
10/14 22:18, , 16F
通常Ct值要控制在15~30內，會被認為數據比較可信喔
10/14 22:18, 16F
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10/14 22:19, , 17F
當然如果你CT38也在standard curve的線性上，應該也OK啦
10/14 22:19, 17F
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11/11 01:03, , 18F
我做的是TAGMAN https://noxiv.com
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01/03 16:46, 7年前 , 19F
01/03 16:46, 19F
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