[方法] Solexa/Illumina sequencing

看板Biotech作者 (狗狗)時間15年前 (2008/10/07 12:39), 編輯推噓12(12推 0噓 51→)
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Solexa於2006年被Illumina併購後 他的Ultra high-thoughput sequencing技術也被轉到Illumina下 但是對於Solexa技術 有許多不了解 我google找了很多資料 還是不能完全了解 希望有人能幫忙解答 1) Solexa對於每個核甘酸片段可以定序多少bp？ 它是定序兩頭還是單邊？ 2) Solexa所使用的特殊核甘酸是什麼原理使得PCR過程可以在每nucleotide配對後停止 然後又可以在下一個cycle又繼續合成下去？ 謝謝了 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.13
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http://0rz.tw/ef4DE 圖解,應該很詳細了
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10/07 23:02, , 2F
謝謝你 這我有看過了 但是沒有得到解答耶 ^^"
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目前我有找到資料寫可以兩端定序 大約36bp左右
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但是每個如何移除那個fluorophore 則不知道
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那個特殊核甘酸結構還是未知 只知道是有屬於私有財產
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推
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它沒有在配對後停止啊,是一直做到完,只是很短
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通常人家專利的東西,不會把所有的都講清楚吧.
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推
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怎麼我的理解是可以做兩端定序,每秒大於36bp以上
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每個cell可以提供每秒總數>3Gb的訊號...
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他是配對一個核甘酸後停止,每次配對都會結合上一個核甘酸
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至於方法不是對核甘酸進行modify就是對polymerse...
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可能利用短時間heat shock的condition配合擴增
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至於為何兩端可以定序只是因為某一片段有兩份copy以上的話
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剛好使用到不同的adapter與cell上的adapter結合,判讀後得知
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它好像沒有說到可以同時對cell上某一個well裡的片段
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同時進行兩端序列的讀取...
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sGoat會不會把Solexa講的太神了呀？
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另外回kitty 專利的東西在申請的時候必須要講清楚
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我找到資料對於該核甘酸的技術 是用私有財產的字眼
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所以很有可能沒有申請專利 只是沒人能知道那是什麼原理
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Solexa最主要是能夠一次定序5千萬種不同的DNA分子
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每個分子只要定序一端20個以上nt 就可以產生unique tag
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再去比對基因體序列資料庫 就知道這片段來自哪裡
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我目前看到介紹好像是可以一邊定序到36nt 可能不是極限
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所以一次可以定1.5 Gbp 若是兩邊定序可達3 Gbp
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他每bp定序是一個cycle 光要掃描5千萬colony就要很久
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掃完後 不知道是用什麼chemistry 將block的fluorophore
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自核甘酸尾巴移除 然後可以進行下一個cycle
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但是木前就是找不到那個特殊修飾核甘酸的結構和原理是啥
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http://0rz.tw/464Ua 請看一下第六頁右半邊
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另外,他每一次cycle是使用CCD camera take一張不用幾秒
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就類似microarray的cell以點圖方式呈現,所以五千萬算小菜
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更正,是第七頁...
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長度問題:現在有兩種kit，分別定18及36個base的長度
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要定兩頭則要用pair-end的kit
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要做pair-end時，要先把一端36base定完
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把序列倒接，再定另一頭
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還有，請不要叫cell，那叫做cluster
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真要叫的話也只有flow cell，上面有8個lane
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利用cluster station將cluster長在上面
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solexa是利用SBS(synthesis based sequence)的原理
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因此單一cluster一個cycle只加上一個base
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再拍四張照片分別detect ATGC上帶有的不同的訊號
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就可以得知這一個cluster在這個base是A or G or C or T
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就如我說的，他是一個flow cell，因此每一個cycle之間
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會pump藥劑將螢光訊號去除，並wash才進行另一次的cycle
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藥劑只寫了Cleavage Reagent，所以我也不知道他是什麼
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還是很謝謝sGoat大的資訊 另外也謝謝cryo大的分享
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我原本想說36個cycle還要用天數來算 以為是用scanning
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CCD camera方式的確是聰明許多
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果然還是需要討論才知道自己哪裡理解錯誤 謝謝大家啦～
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簡單來說 那個特殊核甘酸應該是把螢光劑接在3'端
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可終止elongation 但是用特殊方法移除後 又可添加1 nt
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這樣講應該對吧！？
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papper裡面有提到polymerase以及dye terminator nucleotide
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所以應該是neuclotide會使polymerase只抓到它一個之後就做
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不下去,然後polymerase應該是去除一個subunit使其結合不穩定
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容易脫離template,而neuclotide也有可能是以抗體的方式
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與dye做結合,因此才會有後續的strip可以將螢光去除,又不會
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把neuclotide拔掉,以方便進行second round...
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不過以上都是推測,因為我沒有信用卡可以看那兩篇文章XD
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11/11 01:02, , 62F
//0rz.tw/ef https://noxiv.com
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01/03 16:46, 5年前 , 63F
同時進行兩端序列的讀取 https://daxiv.com
01/03 16:46, 63F
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