[求救] cloning做好多次,表現蛋白一直不對

看板Biotech作者genius012 (過了1/2個大學生活...)時間17年前 (2008/10/05 00:02)推噓4(4推 0噓 3→)

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cloning 已經做好多次了,表現蛋白都很奇怪,想請問一下各位大大我的insert大概是900bp ,primer上有Hind III和Bgl II的切位我PCR後跑膠的位置是正確的我的vector大約為4200bp左右主要是之前學長做過的上有pEGFP,用來表現有螢光的蛋白也用HindIII和BglII(是一起切的) 跑膠後位置也是正確的,切膠純化後(insert和vector的濃度為1ug/ml) ligation做兩組(用T4 DNA ligase--->16度C overnight) 用1:1和1:2(想說兩者濃度相當接近,加上分子量關係)--->不知道是否比例不對 1:1-->總體積是25ul, 1:2總體積是35ul(ligase都加0.5ul) transformation 後兩個比例都有長(正控有長) 但是奇怪的出現--->有兩種菌長出(一種有表現但較淡,另一種相當綠) 拿去做蛋白誘導後,(主要是希望誘導出insert接上EGFP蛋白) 較綠的菌表現的蛋白相當接近EGFP蛋白的分子量(29kD) 另一個綠色顏色較淡表現的蛋白竟然相近原來做vector的plasmid(pEGFP-N230) 都沒有預期的蛋白分子量這樣是表示切膠沒切好嗎? ligation效率很差? 可是做很多次,蛋白表現都怪怪的...好詭異拜托了在transformation後的兩個表現的菌種,有去抽其質體DNA, 並用HindIII和BglII切過綠色螢光蛋白較強的跑出的DNA經限制每作用後有大概在4000bp左右且是兩個微弱的band, 但另一個綠螢光蛋白表現較弱的經限制每作用後跑的位置與當初plasmid用限制每切過後的兩個band差不多(4000bp與700bp附近) 因為學長希望再確認一些再拿去定序, 目前是專題生... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.127.205.99

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huhu126

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huhu126

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※ 編輯: genius012 來自: 59.127.205.99 (10/05 02:22)

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blence

10/05 03:01, , 3^F