[求救] PCR p不出來

看板Biotech作者 (Justin)時間17年前 (2008/09/25 00:36), 編輯推噓14(14推 0噓 12→)
留言26則, 14人參與, 7年前最新討論串1/1
小弟 最近在P一個基因的promoter (GC%=42% 長度=1kb) 所以先從genomic DNA開始做起 然後就是設計primer 我有設計和paper一樣的如下 5' Tm GC% CCG A/CCGGT GAGCTC AAA TCA GTC AAA CCT AAG AA 65.5 49 ------- -------------------------- enzyme cut complement to genomic DNA 3' GA A/GATCT CTC GAG GGCC ATG GCG CCG GCT CGT GCT T 73.3 65 ------- -------------------------- enzyme cut complement to genomic DNA 讓我覺得很奇怪的是 paper為何會在5'端設計多出 GAG CTC 這段序列??? 而且還讓 5'和3'primer這端互補(3' CTC GAG) 把它拿去P之後 94(5min) {94(30s)-annealing tm(30s)-72(1min)}30個cycle --72(10min)--4oC 嘗試過annealing 的溫度 56.3 57.4 59.0 60.7 63.2 65 66.6 67.8 68.9 69.3 結果是都沒有P出來 而且在3kb有很強的band(冏) 所以我是不是應該把GAGCTC這段序列拿掉??? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.124.101.163
推
09/25 00:46, , 1F
GAGCT/C --> SacI切位.
09/25 00:46, 1F
→
09/25 01:05, , 2F
可是我不用 用到這個cutting site阿
09/25 01:05, 2F
推
09/25 01:15, , 3F
那就不要放啊XD 你也太可愛了
09/25 01:15, 3F
→
09/25 01:18, , 4F
學姊 叫我放的........
09/25 01:18, 4F
推
09/25 03:16, , 5F
我笑了～～
09/25 03:16, 5F
推
09/25 13:33, , 6F
孩子~是你要對自己的實驗負責~學姊學長甚至是老闆的
09/25 13:33, 6F
→
09/25 13:34, , 7F
交代~ 你也要自己邏輯思考之後再去動作~不然要是出包
09/25 13:34, 7F
→
09/25 13:34, , 8F
那些人沒人會跳出來幫你扛的
09/25 13:34, 8F
→
09/25 13:35, , 9F
甚至可能還會在開會時聯合指責你~
09/25 13:35, 9F
推
09/25 16:58, , 10F
大推樓上...
09/25 16:58, 10F
推
09/25 17:42, , 11F
primer的方向性是不是寫錯了？
09/25 17:42, 11F
推
09/25 17:46, , 12F
看不出來會形成dimer，產物拿去定序看看吧
09/25 17:46, 12F
推
09/25 23:37, , 13F
同意davideason的說法 不過另外建議原PO 可以把你的想法跟問題
09/25 23:37, 13F
→
09/25 23:38, , 14F
先和老師學長姐討論 他們應該會比版上的朋友更了解你的實驗
09/25 23:38, 14F
推
09/25 23:42, , 15F
討論的結果或許會更加完善
09/25 23:42, 15F
→
09/25 23:44, , 16F
btw, paper上的序列有時候可能會錯(我就遇過XD) 若database查
09/25 23:44, 16F
→
09/25 23:45, , 17F
得到原始序列可以自己先確認看看是否正確
09/25 23:45, 17F
推
09/26 00:14, , 18F
樓上說的沒錯,paper的序列可能"惡意筆誤",到BLAST確認一下
09/26 00:14, 18F
推
09/26 01:55, , 19F
惡意筆誤.....這是指什麼意思 可以說明一下嗎
09/26 01:55, 19F
推
09/26 08:09, , 20F
惡意筆誤 就是該paper作者有所保留~不想讓別人知道!所以小
09/26 08:09, 20F
→
09/26 08:10, , 21F
小修改一下~~~ 有的真的會這樣!BLAST一下比較保險~
09/26 08:10, 21F
推
09/28 01:56, , 22F
囧惡意筆誤的還能登出來Orz..
09/28 01:56, 22F
推
09/29 00:10, , 23F
可以 不影響實驗結果
09/29 00:10, 23F
→
09/29 10:50, , 24F
現在的小朋友越來越可愛了
09/29 10:50, 24F
→
11/11 01:01, , 25F
討論的結果或許會更加完 https://muxiv.com
11/11 01:01, 25F
→
01/03 16:45, 7年前 , 26F
看不出來會形成dime http://yofuk.com
01/03 16:45, 26F
‣ 更多 EscaflowneXP 的文章
文章代碼(AID): #18scoc1q (Biotech)