[求救] 會產生雜band的primer會讓定序失敗嗎?

看板Biotech作者 (Part time研究生~)時間15年前 (2008/08/31 19:19), 編輯推噓7(7推 0噓 10→)
留言17則, 7人參與, 5年前最新討論串1/1
先說, 我的primers不會在目標基因中段裡面有互補,只會在頭尾有, 但我用這組primers去p經純化後的gene卻仍然會產生雜band(size較小), 那我想請問,如果我用這組primers來定序目標基因的話, 會造成全段序列無法定完嗎? 因為我之前送過一批定序, 是把目標基因經過pcr後跑膠切band回溶等處理,再送定序, 但結果卻都定不完全長,定序圖上後面peak都消失不見了, 雖然當初送的sample濃度似乎有點低, 但我想問,是否定序失敗也可能是因為這組primers所導致的呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.142.62
推
08/31 19:35, , 1F
你第一個問題!既然有雜band你再拿那組paimer去定的話~一定
08/31 19:35, 1F
→
08/31 19:36, , 2F
是雜訊!!! 第二個問題~ 你的band多大~大部分定序公司都會
08/31 19:36, 2F
→
08/31 19:37, , 3F
說~他們機器大約只能定出多少大小的序列!一般為800左右
08/31 19:37, 3F
→
08/31 19:38, , 4F
所以比較大的序列都會定兩端去接!或者再送中間的引子去定~
08/31 19:38, 4F
推
08/31 19:44, , 5F
有雜band有可能會影響結果，2端都分別試看看
08/31 19:44, 5F
→
08/31 19:58, , 6F
目標大約1100bp,我有用兩頭去定,但都不到300就沒訊了,
08/31 19:58, 6F
→
08/31 19:58, , 7F
其中FP是我自己設計,但RP是別人paper寫的,他們也做定序,
08/31 19:58, 7F
→
08/31 19:58, , 8F
所以想說如果問題是在primer,那我就乾脆FPRP都用他們的.
08/31 19:58, 8F
→
08/31 20:00, , 9F
anyway,thanks~~~
08/31 20:00, 9F
推
08/31 20:28, , 10F
定序時還要再用其中一股primer在p一次 應該會更亂..
08/31 20:28, 10F
推
08/31 20:30, , 11F
我建議是提高template濃度再試試!參考看看吧!
08/31 20:30, 11F
推
09/02 20:26, , 12F
基X米克斯的F&Q有你類似的狀況http://www.genedragon.co
09/02 20:26, 12F
推
09/04 16:20, , 13F
建議condition test 提高PCR溫度 雜Band會影響結果判讀
09/04 16:20, 13F
→
09/04 16:22, , 14F
Gel extractiona沒純化好 也會有所影響
09/04 16:22, 14F
推
09/04 16:26, , 15F
不然設計兩對primer來overlap這個基因
09/04 16:26, 15F
→
11/11 00:57, , 16F
有雜band有可能會影 https://muxiv.com
11/11 00:57, 16F
→
01/03 16:44, 5年前 , 17F
說~他們機器大約只能定 http://yofuk.com
01/03 16:44, 17F
‣ 更多 sleepyday 的文章
文章代碼(AID): #18kdvLIW (Biotech)