[求救] 有關pcr的問題?

看板Biotech作者 (chi)時間17年前 (2008/06/12 18:00), 編輯推噓6(6推 0噓 10→)
留言16則, 6人參與, 最新討論串1/1
最近在做cloning,要把學姊之前clone出來的cDNA(3kb)放入expression vector, 進行蛋白質表現,但我發現cDNA量已不足,自己想amplify這段cDNA,我利用 這段cDNA當作template,而primer則是使用當初夾出這段cDNA的那對primer, 所有反應條件都參考之前學姊的條件,我試了很多次都不成功,結果都沒目標片段, 都是一些分子量約100~500bp的片段.這個問題已困擾很久,希望有心人士能夠給點指引. 感激不盡 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.121.155.210
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06/12 18:27, , 1F
很多次都一樣的條件?還是有不同的ctrl conditions?
06/12 18:27, 1F
推
06/12 19:02, , 2F
學姐clone出來的cDNA是塞進哪一個vector? 菌株已經不在了嗎?
06/12 19:02, 2F
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06/12 19:04, , 3F
學姐作出來的只是一個3K PCR fragment嗎 應該會送進vector
06/12 19:04, 3F
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06/12 19:06, , 4F
如果這個plasmid還在 以此為template比較夾的出來
06/12 19:06, 4F
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06/12 19:07, , 5F
如果只有fragment 有時nestPCR會夾不太出來喔 妳可以嘗試
06/12 19:07, 5F
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06/12 19:09, , 6F
用該物種原來的cDNA當模版重新夾一次 3K滿長的 加油
06/12 19:09, 6F
推
06/12 21:26, , 7F
我建議先送定序看看序列有沒有問題
06/12 21:26, 7F
推
06/12 21:28, , 8F
secondary structure，提高annealing temperature試試。
06/12 21:28, 8F
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06/12 21:29, , 9F
或者拿妳學姊當初P出來的sample再p一次。
06/12 21:29, 9F
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06/12 21:29, , 10F
講錯，是template
06/12 21:29, 10F
推
06/13 00:25, , 11F
其實我看不懂什麼是clone出來的cDNA .. cDNA是從RNA反轉錄的
06/13 00:25, 11F
推
06/13 00:27, , 12F
想問一下，加入DMSO可以避免secondary structure嗎？
06/13 00:27, 12F
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06/13 00:27, , 13F
％數最多可以到多少？
06/13 00:27, 13F
推
06/13 00:29, , 14F
clone出來的cDNA指的是當初你學姐在吊出這個基因時，一定會
06/13 00:29, 14F
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06/13 00:30, , 15F
放到一個vector上....那麼之後你就可以利用這個clone直接放
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06/13 00:31, , 16F
大你的目標基因....
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