[求救] stable clone挑選

看板Biotech作者 (新的里程)時間17年前 (2008/06/02 00:22), 編輯推噓3(3推 0噓 10→)
留言13則, 3人參與, 最新討論串1/1
第一次製作stable clone 很多地方不清楚 請各位大大不吝賜教!!! 我的基因是放在pEGFP-C1 vector內 使用Daoy cell line 利用invitrogen的Lipofectamine 2000進行transfection transfection後四天(96hr)換為含有G418(400ug/ml)的medium進行篩選 加入G418經過四天 沒有見到預期的無螢光細胞大量死亡 我的問題是 1.transfection後多久可以加入G418? 濃度為何? 2.G418(100mg/ml)於4度C下可保存多久? 3.加入G418後多久可明顯看到沒有抗藥性的細胞死掉? 4.含有G418的medium需要每天換嗎? 5.我是使用6孔盤進行實驗 若最後僅剩下帶有螢光的細胞 如何將其移出至25T flask培養? 問題有點瑣碎 麻煩各位前輩了 謝謝!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.167.168.251
推
06/02 00:25, , 1F
不同種的cell對g418的抗性有異，可做個ct抓適當的濃度
06/02 00:25, 1F
→
06/02 00:27, , 2F
我們家是-20保存
06/02 00:27, 2F
→
06/02 00:28, , 3F
此外這篩選可能要1到2個禮拜的時間 可能不是4天可以解決的？
06/02 00:28, 3F
推
06/02 01:50, , 4F
stable clone 2-4星期 濃度沒參考的話自己試
06/02 01:50, 4F
→
06/02 01:51, , 5F
另外transfection後大概養24小時候subculture就可以
06/02 01:51, 5F
→
06/02 01:51, , 6F
加..不過時間一樣看細胞株特性決定
06/02 01:51, 6F
→
06/02 01:52, , 7F
養滿了就subculture 多的可以丟棄 反正只要有就好
06/02 01:52, 7F
→
06/02 01:53, , 8F
通常transfection完後的第一個禮拜細胞都還不太會死
06/02 01:53, 8F
→
06/02 01:54, , 9F
第二個禮拜開始就屍橫遍野<--勤換medium吧Orz
06/02 01:54, 9F
推
06/02 01:56, , 10F
開始大量死亡之後我就只換medium 讓存活的長成
06/02 01:56, 10F
→
06/02 01:57, , 11F
single colony..如果這時候subculture不太好..
06/02 01:57, 11F
→
06/02 01:58, , 12F
最後會變成多細胞來源..而非單一細胞..
06/02 01:58, 12F
→
06/03 22:33, , 13F
感謝n大和t大經驗分享~
06/03 22:33, 13F
‣ 更多 ginkgo0926 的文章
文章代碼(AID): #18GipQG_ (Biotech)