[求救]關於liver tissue的IP
小弟最近要搞出個growth hormone在mouse liver造成STAT5 phosphorylation的實驗,
方法大致是打growth hormone於小鼠腹腔,（處理不同時間）
犧牲後取liver用RIPA(含protease inhibitors)磨好,
然後用protein G beads preclean過,
用anti-STAT抗體去做IP,
再用anti-phosphoSTAT5去做IB,
無奈一直做不出來.
上述兩隻antibody都是santa cruz（弘晉）的, （我想大家都會會心一笑）
但在確定我sample preparation實驗過程都是ok前,我不會輕易說人家的東西有問題.
實驗結果大概如下：
我嘗試做過IP, phosphoSTAT5的IB沒有signal,要不就弱到靠背,
將membrane strip過後, 用anti-STAT5做IB,
結果雜band多, 但沒有我要的size,要不也就是很弱,根本沒法確定是不是STAT5,
也嘗試將liver extract直接做IB, anti-STAT5做出來是有幾條band,但size都不對,
另外在底片上110KD以上的部份有像smear的雜訊,以為是liver sample沒處理好,
但membrane拿去染coomassie blue又是好好的(band是band,漂亮的很),
也用3T3L1 cell line的cell lysate跑過IB,也有相同雜訊的情形,
所以應該不是liver tissue造成.
一直卡在這瓶頸好久了,望達人們伸出援手,指點迷津.
By the way,
有人遇過做IP前要先將extract在boil buffer中煮過然後再做IP嗎ꄊ 一般能做IP的antibody不是認native form的protein? 煮過就......?
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