[求救] 有關Southern blot的問題
小弟我是做yeast的
想用Southern blot去確定我knock out的gene的construct對不對
因為實驗室沒人會做 所以一切都自己摸索
但是碰到一些問題 希望板上的大大可以幫忙一下
我是用P32 label的
我的positive control也都有band
但是其他都完全看不到任何的band
所以我把我實驗的流程PO出來 希望有做過的人可以指正一下
1.抽取yeast genomic DNA,取10ug用限制脢作用
(這裡酵素的unit大概要加多少,我看過滿多不同的版本)
2.把做用完的DNA跑膠,跑完後泡EB,照UV燈畫marker
3.把膠依序用0.25N和0.5N NaOH&1.5N NaCl和3M NaCl&0.5M Tris-Cl pH=7
分別作用30分 60分 60分鐘
4.做transfer o/n
5.將membrane做cross-linking(照UV)
6.pre-hybridization & hybridization
後面因為我positive control有band,所以不多加以敘述
不知道我這實驗過程有哪可以改進或出錯
因為我是實驗室新手,可能犯了一些好笑的錯誤,希望大大多包涵
最後我想問一下,positive control大約加多少量比較合適
先謝謝願意幫忙的板友,非常感謝你們^^
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推
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