[求救] 免疫組織染色染不出來~
最近實驗室要做免疫組織染色IHC
我所要染的組織是大鼠的大腦，這次要染的是MPO, nfkb
做冷凍切片後用oct包埋~
我照著實驗室之前學長姊所留下來的protocol做
但是一直染不好，有時候會出來有時候不會。
最近更慘，呈色時一點顏色也沒有。
請各位大大幫我看一下我的步驟有沒有問題
我的染色步驟
1.先用paraformaldehyde固定 5min
2.用pbs wash
3.冰醋酸 5min
4.pbs wash
5.3% H2O2 30min
6.PBS wash
7.serum blocking 30min
8.PBS wash
9.primary anti-body 4度C overnight
10.PBS wash
11.secondary anti-body 1hr
12.PBS wash
13.ABC kit
接著以nickel+DAB 呈色
大至上來說~步驟我是覺得沒有什麼問題~因為學長姊染的出來
不過隨著學長姊的畢業~這些東西也跟著走了~
在呈色後，檢體上沒有顏色讓我很慌
一開始是覺得我的細胞打洞沒有打好
所以我試著延長冰醋酸的時間(沒有稀釋)或使用tritonX-100
沒有效，接下來我增加的是一抗的濃度、時間都還是沒有效
我覺得有可能是因為那隻一抗有問題，所以使用一隻NeuN同時進行染色
(染神經細胞來確定我的染色有沒有問題)
染出來之前neun的效果還不錯，但是現在連neun都不是很明顯
二抗的物種我可以確定我沒有用錯，我現在不知道還有什麼方法可以試
怎麼讓我的染色品質更穩定，整片沒有顏色我是該說我洗的太乾淨了嗎?
試了很久都沒有什麼起色...
請問我現在還有什麼方法去看我哪裡出問題?或是各位有什麼建議~感謝~
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