[求救] 要做長片段的PCR

看板Biotech作者 (Je t'aime)時間18年前 (2007/11/29 11:58), 編輯推噓7(702)
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最近要夾一個片段 估計裡面是有intron存在 因為用cDNA是可以夾出來 但是換成genomic DNA就不行了 跑完膠後乾乾淨淨 一點東西都沒有 想說可能是片段太長了 有爬文看了一下 不過還是不太懂 如果將Taq換成Pfu可以改善嗎? 我們家是用invitrogen的Taq DNA polymerase 還是我將extension時間拉長就可以了? 目前是設定 3 min 那dNTP的濃度要提高嗎? 目前是2mM 5ul 希望大家可以幫我解答一下 拜託了謝謝 p.s大小預估是4kb 這樣普通的Tag有能力做的出來嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 192.192.90.211

11/29 12:02, , 1F
如果太長, 我會做兩條, 在把兩條接起來
11/29 12:02, 1F

11/29 12:22, , 2F
也有專門作長片段的taq。或是多作幾個primer組合確認一下。
11/29 12:22, 2F
※ 編輯: kvw 來自: 192.192.90.211 (11/29 13:25)

11/29 13:32, , 3F
Pfu產量比Taq還差耶 可以用fusion pcr
11/29 13:32, 3F

11/29 13:33, , 4F
最簡單的還是如樓上所說 做兩條接起來
11/29 13:33, 4F

11/29 13:44, , 5F
我有夾過3K,用的是taq+pfu 1:1混合,並加DMSO增進產物
11/29 13:44, 5F

11/29 19:15, , 6F
pretreat with suitable restriction enzyme
11/29 19:15, 6F

11/30 12:23, , 7F
我用過百力的blend taq作3.5kb...產量多又專一喔
11/30 12:23, 7F

12/01 11:55, , 8F
我之前經常作5K的片段用的是hotstart Taq
12/01 11:55, 8F

12/01 11:57, , 9F
也是加DMSO增加效率 不過濃度是2%
12/01 11:57, 9F
文章代碼(AID): #17JZZspA (Biotech)