real time PCR遇到問題!!!
我將老鼠組織抽其RNA,抽RNA過程有使用到phenol跟chloroform,
抽完後,做RT,然後做real-time pcr,
第一次這樣做都沒出現任何問題,基因也做完了,
然而老師要我再做另一隻老鼠,一般實驗都會做兩隻以上一樣情況下的老鼠基因PCR,
於是這次我一樣抓另一隻老鼠,方式同第一次,抽完RNA做RT,
重點是RT做完後,我就先用一般的PCR先看RT有沒有成功,我GAPDH放大約19 cycle就
pcr出來了,於是我就去做real time pcr,奇怪的事出現了,居然偵測不到,
第一次做GAPDH大約在15~20 cycle之間就可以PCR出來,但是這次real time pcr
我調到44cycle,居然也看不到GAPDH這個基因,這只是我的control而已阿> <
我再回去用一般PCR機器(加的enzyme是taq),的確在19 cycle就pcr出來,
但是real time pcr就是失敗!!!
重點來了,我拿上去的template來做,的確GAPDH在15 cycle左右就出現曲線了阿,
為何這次的template居然在rt-pcr可以成功p到GAPDH,但是用real time pcr就失敗= ="
怎麼說都搞不懂,如果RT失敗,應該連一般PCR都失敗阿,為何只有REAL TIME PCR失敗阿
高手救我阿,還是我有phenol或chloroform些微殘留,卻只會影響real time pcr的螢光
enzyme,一般的enzyme都不會影響???real time pcr的enzyme是不是比較脆弱阿= ="
救我阿 做到快哭了 還是重抽RNA,然後小心一點= =
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