[求救] 偵測細胞內脂肪含量
小弟現在在做脂肪肝的細胞模式(HepG2)
理論上
當游離脂肪酸的供給濃度增加而導致胞內脂肪堆積增加(dose-dependent)
-> Gomez Lechon-2007
也可能隨時間而增加累積量(time-dependent)
-> 肉眼觀察
我可以使用Oil Red O或Nile Red作出phase-contrast或螢光相片
也有感覺累積量有明顯差異
但是我卻沒辦法很正確且穩定地對它定量 以下是我曾經操作過的方法
1.利用Oil Red O染色退染後 將細胞內的染劑再溶出後析光分析
(穩定 但是顯著性不足)
2.以Nile Red染色後用flow cytometry分析
(因為Ex549/Em599, 但是校內只有488,
雖然Jara-2003曾指出可以Ex488/Em560-640 + Em650-可以分析
但是我的結果一直很不穩定 連positive也看不見顯著增多)
3.以lipase-based方式
(Pointe Scientific,Triglyceride(GPO)(Liquid)Reagent Set)
先低張液配合反覆冷凍取得lysate後,定量的lysate混合methanol/chloroform(1:2)
室溫轉隔夜後取有機層 抽氣乾燥 以小體積絕對酒精回溶 然後加入TG試劑測濃度
結果也沒辦法穩定呈現理論值 顯著性也不高
因為我將來要用分析某些cytokine甚至於天然萃取物是否能減低脂質堆積
所以必須有一個穩定的量化方式以提供佐證
特此請教各位先進
關於上述三種方法有沒有什麼經驗可以分享 或者還有其他建議方法
(isotope我確定不會利用.HPLC可能也還沒辦法支持..)
感謝
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