[求救] 幾個有關於Western的問題

看板Biotech作者 (piggy)時間18年前 (2007/07/21 21:38), 編輯推噓14(14推 0噓 17→)
留言31則, 9人參與, 最新討論串1/1
大家好，最近我才開始在做Western blot 遇到幾個實驗的問題不知怎麼解決， 跟老師討論她只會跟我覺得我的過程有問題 然後就不了了之 不然她就是會跟我說以前別人跑都不會這樣 為什麼我跑就會這樣 實在是很無言 根本沒有改善到一些步驟或方法 因此想上來這裡問一下有經驗的大家 請大家指點我一下 謝謝 (附上我的實驗照片 http://www.pixnet.net/photo/lmlt/59429915) (1)底片壓出來後，發現除了我要的蛋白質外，還有許多雜band而且背景很髒，請 問一下這是因為抗體的關係或是wash沒洗乾淨？(我都大約wash10分鐘，6次) (2)平常我是用TBST泡5%的脫脂牛奶blocking，但是有聽過其他老師是用2.5%的， 這樣不同濃度的奶粉對於blocking會有什麼影響嗎？ (3)平常我想要觀察的蛋白質在正常細胞內表現量很低，因此老師就會叫我用50ug 的量去跑電泳，但是這樣actin跑出來的band就會連在一起而且會很濃，但是 如果把蛋白質的量減半的話，又怕target protein會看不到，請問有比較恰當 的方法 可以解決這個問題嗎？ (4)因為剛接觸到western，跑出來的結果真的好醜，很想努力做出漂亮的結果 想請教一下各位除了molecular cloning這本書可以參考之外，還有什麼書或 資訊可以了解或改善這個技術？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.123.13.28 ※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/21 21:40) ※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/21 21:53)
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blocking多久?
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怕actin太多的話可以先壓秒數短的 反正證明你濃度一
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樣就好 不然就用掃膠做時間點吧= =
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blocking室溫，一小時
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有些抗體不適合應用在某些樣品中
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可是老師會說之前學妹做的出來....我就做不出來
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因此這個理由應該很難使她相信
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blocking時間拉長 milk濃度拉高 二抗降低
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目前二抗用的濃度是1:1000，這樣是否太濃了？
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二抗濃度該用多少,隨個別抗體狀況完全不同,只能說要靠你
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自己去 optimize. 跟保存的狀況也有關係
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如果你覺得背景值太高,可以試著降低二抗濃度
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嗯嗯背景真的很強 降低2抗濃度吧
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調整2抗dilute倍數 wash久一點 壓片時間也可以調整
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試試看囉
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你學妹之前做是很乾淨 single band嘛?
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請教一下你學妹 比較一下作法 可能有些小地方你忽略了
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看別人做過跟自己動手的差異就在常常有些小地方被忽略了
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推
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二抗濃度太高 試試1:5000或1:10000 至於blocking的時間
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不需要太長 我老闆都叫我做15分鐘就好 我做的結果也都不
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錯 wash也不用太久 TBST或PBST rinse兩次 最後再wash
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五分鐘就好 我覺得你的問題是二抗造成的background 至於
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actin的signal太強 你可以把actin一抗的濃度再降低
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推
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試著把降低濃度的二抗泡在blocking裡面,可降background
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推
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謝謝大家給我的意見，我會再去試試的
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至於學妹做出來的結果其實我沒看過，那是老師之前找的大學
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部工讀，可是我覺得之前做的不一定可信，因為依照之前做的
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老師跟我說ACTIN的大小和我實際跑出來以及去請教別人的都
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不同，但是之前她在跑時老師卻都沒有發現這件事，因此跑出
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來的結果我是存著懷疑的態度，因為我們老師是那種會依照
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自己的“推理”去找出看起來應該是DATA的人 = = "
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※ 編輯: piggylo 來自: 122.123.13.28 (07/22 03:02)
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