[問題] PCR反應一直失敗~有勞高手

看板Biotech作者 (暱稱小公主的!扣十分先)時間18年前 (2007/07/17 23:56), 編輯推噓10(10推 0噓 7→)
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※ [本文轉錄自 Wanted 看板] 作者: ronall (暱稱小公主的!扣十分先) 看板: Wanted 標題: [問題] PCR反應一直失敗~有勞高手 時間: Tue Jul 17 23:50:44 2007 是這樣的 我是做蛋白突變的研究生 我利用抽取自菌種的DNA 佐上設計好的突變用引子(35-mer) base pair的突變數相較於原始DNA不會超過三個 我的研究主題目前打算先做三個單點突變 我將突變過的DNA送入E. coil以表現我要的突變蛋白 但是目前有個情況 就是三組點突變的PCR中 有一個打死都做不出來..... (在DNA Gel中沒看見EtBr的band) 在同樣的條件、環境、手法、材料下 一開始懷疑是引子問題 也重新訂購過新品 但是結果仍然 我實在找不出失敗的原因了 因為另外兩個都沒問題 我使用的材料如下 ================================== Sterile water 1 uL Pfu 10X rxn buffer 5 uL dNTP (10 mM stock) 1 uL Template (25 ng) 2 uL (the plasmid DNA from DH5-alpha) Primer forward (125 ng) 20 uL Primer reverse (125 ng) 20 uL Pfu DNA polymerase (2.5-3U) 1 uL ================================== 反應條件 ================================== 95 C 30 sec-cycle 1次 ---------------------------------- 95 C 30 sec 55 C 1 min 68 C 13 min-cycle 17次 ================================== 反應結束後 再加入Dpn1限制酵素切斷template 在37 C下反應一小時 這樣的程序可能會有問題嗎? 我也考慮過是不是當初選用的codon不合? 或者是實驗室也有Taq DNA polymerase 我換用這樣的polymerase會有成功的可能嗎? 此外 我不知道使用Taq DNA polymerase時 各成分的配比要放多少 如果有知道的高手還請幫忙~!! 最後 我不是分生體系的啦 所以有很多比較細節的東西我不懂....還請見諒 -- 耶 　 (十字架)▕ 實┌───────┐(講台上) 耶穌問正在seminar的我　　 蘇 ● ▕ 驗│ ︿囧︿ │ 耶穌：小鬼，你混哪的？怎麼 的 　▔耶▔ ▕ 室│ 我 │ 　　　比我被釘的還慘....？ 信 ∥ ╭──╮▕ 的└── ╱╲ ──┘╭──╮ 我 ：主啊，我是研究所新生 徒 　 ╭│偉大│▕ 人 ╔═══╗╭─│去死│ 　　　 們=> ○●○●╰──╯▕ 們=> ○●○●○● ╰──╯ www.wretch.cc/album/ronall -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.225.199.14 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.225.199.14
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07/18 01:21, , 1F
55℃->52℃, template 25ng->100ng to 500ng,請參酌試試
07/18 01:21, 1F
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07/18 01:25, , 2F
其他的,尤其是primer,請參照說明書指示使用
07/18 01:25, 2F
推
07/18 03:27, , 3F
我做過類似的.但我是變換兩個鹼基.模板濃度提高.引子設計
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07/18 03:29, , 4F
要注意某些條件.DpnI處理要注意溫度條件.最重要的是
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07/18 03:32, , 5F
你的模板(環型質體)長度.看你是用哪一個點突變kit!!
07/18 03:32, 5F
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pfu可以用taq代替..但是可能出錯率會比較高一些
07/18 03:33, 6F
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07/18 08:56, , 7F
你要不要換用PCR mutagenesis的方法?
07/18 08:56, 7F
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07/18 12:08, , 8F
cycle數可以提高到 35 17個cycle 太少了
07/18 12:08, 8F
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07/18 23:04, , 9F
我已經快要投降了...拿給專門在做PCR的研究生也是無解...
07/18 23:04, 9F
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07/18 23:05, , 10F
我同學連用Taq都做不出來~也不過才6kb呀......
07/18 23:05, 10F
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07/19 05:27, , 11F
Wait 你說的做不出來是沒有band還是得不到你要的construct?
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我用這種方式做過很多次了 作多我做過換掉十幾個bp
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通常這種方式PCR做完，跑膠是看不到band的
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要一直做到transformation，看有沒有菌落才知道成敗
07/19 05:31, 14F
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07/19 10:22, , 15F
是沒band!我是沒有直接轉入cell~但是其他的兩個突變用DNA
07/19 10:22, 15F
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07/19 10:22, , 16F
在DNA gel中能夠看見PCR產物
07/19 10:22, 16F
推
07/19 15:51, , 17F
那我只能說不需要看到band，至少我們實驗室是這樣做的
07/19 15:51, 17F
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