[問題] E.coli會跳過TAA stop codon嗎？

看板Biotech作者 (～四條魚～)時間18年前 (2007/06/03 12:46), 編輯推噓5(5推 0噓 7→)
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現在我在蛋白質表現上遇到一個奇怪的問題 希望有經驗的前輩可以指點 我用pGEX vector送入BL21(DE3)作蛋白質表現 Insert是一段完整的ORF（帶有TAA作為stop codon） 此ORF約50kDa 但經過表現、純化後 我的蛋白質變成56kDa 多了6kDa以上 我回去看我的DNA序列 發現到我ORF之後還有一個stop codon（TGA） 可能是PCR夾進去或vector原本的 稍微畫個簡圖好了@@ GST atg Insert ORF taa tga -{-------}--[-------------------]-----------】----- 如果計算到後面那個tga的長度 的確約56kDa 所以我就有個疑問... 跳過taa stop codon的機會大嗎?? 難道BL21比較喜歡tga當stop codon....= =" 還是在transcription就有問題了？ 因為我只單純insert ORF而沒考慮terminator 希望有人能提供一些想法@@ 謝謝！ -- PS. GST到insert之間只有幾個amino acids而已 所以不會多到6kDa那麼多 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.127.215.12 ※ 編輯: Fourfish 來自: 140.127.215.12 (06/03 12:47)
推
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會不會你的蛋白質被修飾了所以變大？
06/03 12:52, 1F
推
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point mutation倒楣剛好在taa上?再repeat一次試試看吧
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總之我會往sequence有問題,taa根本就沒在上面的方向想
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如果你的insert是PCR夾出來的,那更有可能是這樣的問題
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推
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你是run SDS-PAGE check的嗎？我會覺得 PAGE 稍微不準沒關
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推
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回someday大:我覺得我的蛋白質應該不會被修飾@@
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回n大:我送了兩組DNA作定序 但兩組都沒問題呢 TAA都在
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所以應該不是taa mutated+定序錯誤的問題~"~
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回shuyanc大:我是跑SDS-PAGE沒錯 只是如果將我重組產生的
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protein和原protein一起跑SDS-PAGE差距就會很明顯
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推
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原protein和表現protein還差了GST的大小，所以你如何估計
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06/15 14:42, , 12F
表現蛋白質到底多了多少呢？
06/15 14:42, 12F
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