[問題] transfection後stable clone之選擇問題
請教諸位高手
我想要讓腫瘤細胞表現特定蛋白質
選用的系統是invitorgen的GFP Fusion TOPO vector
可以用geneticin做selection
transfection reagent選用Fugene
做完transfection後兩天 觀察到有部分細胞有明顯發亮
但是比例不高 而其他細胞是完全不會亮
以kit所附的GFP plasmid做的control 會亮的細胞比例也是差不多
於是換了含有geneticin的medium培養 預備將有transfect成功的細胞篩選出來
很多細胞就脫落死亡
換過兩三次medium後subculture
control組的(fugene only)的細胞是完全死光了
理論上來說剩下的細胞可以抵抗geneticin 應該是可以表現GFP
可是我去看螢光 本來期待可以看到繁星點點
可是卻發現很亮的細胞變少了
但是視野下充滿了微微發亮的細胞
科學一點的講法 很亮的細胞曝光1/4秒即可抓到影像
微亮的細胞曝光時間拉到一分鐘也不是很清楚 但是從目鏡可以肉眼觀測到
不知道諸位有經驗的達人 這樣算是有篩選成功嗎
還是要整盒細胞都會非常的亮呢
微亮的細胞是背景嗎
可是先前(fugene only, no plasmid)組的細胞是一點亮度也沒有的
感覺十分迷惑
我已經收下一部分的細胞預備以western測試我的表現蛋白
但是還是想先請教一下有經驗的達人
這種狀況是發生了什麼事呢
感激不盡!!
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推
05/30 10:52, , 1F
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