[問題] RT-PCR

看板Biotech作者 (像笨蛋一樣)時間19年前 (2007/04/17 12:02), 編輯推噓5(5推 0噓 4→)
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查了一下前文,沒有問到類似的問題,請教版上前輩 設計了一組primer, forward tm 57.4, reverse tm 56.6 長度都是 22 mer PCR product為188 bp 用pcr 去夾genome DNA確定可以夾出一個很亮的band,大小也正確 可是當做RT-PCR想去夾該基因的時候 卻出現兩個band 一個為 188 bp比較弱, 一個為約260~270 bp 較亮 想了很久不知道有什麼原因會這樣 cycle 為 95度 30秒 54度 10秒 68度 15秒 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.151.142
推
04/17 12:34, , 1F
你的primer設計不好,導致cDNA裡頭有別的序列夾出來
04/17 12:34, 1F
推
04/17 13:46, , 2F
可是我有用primer 所夾出的sequence去 blast原來的genome
04/17 13:46, 2F
→
04/17 13:47, , 3F
並沒有against 其他片段
04/17 13:47, 3F
推
04/17 15:04, , 4F
但你有沒有去check你的DNA->RNA時,有新的序列出現,懂嗎
04/17 15:04, 4F
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04/17 15:06, , 5F
因為轉錄後要除去intron..就有可能有新的連續序列
04/17 15:06, 5F
推
04/17 15:31, , 6F
謝謝前輩的回答喔！只是我現在做的是E.coli~
04/17 15:31, 6F
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04/17 15:31, , 7F
恩～ 我再想想看 轉cDNA時 是否有可能出現不一樣的序列
04/17 15:31, 7F
推
04/17 15:55, , 8F
建議你去做sequecing,因你的是原核cell,所以有可是..
04/17 15:55, 8F
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04/17 15:56, , 9F
pcr產物自己黏在一起,再做pcr...才導致大片段
04/17 15:56, 9F
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文章代碼(AID): #1694Q-wm (Biotech)