[問題] western blotting!! 常抽到DNA!!造成拖帶...

看板Biotech作者killmebaby (不錯喔)時間19年前 (2007/04/14 20:35)推噓7(7推 0噓 1→)

留言8則, 5人參與討論串1/1

最近做western blotting時,不知到是cell lysate處理的不好,還是怎樣,都會抽到DNA, 造成在跑SDS-PAGE時,都會看到明顯的拖帶現象.. 試過離心多次一點,或是lysis buffer加多一點,但好像都沒有改善,還是會隨機的抽到DNA. 可以請大家告訴我幾個方法嗎?快被這一點搞昏了.... 謝謝大家!! 我的protocol: 1.using cold DPBS to collect cell 2.RIPA lysis buffer(我怕說是不是太強,打破核膜,才會拿到大量的DNA,因為我們 lab要看細胞膜上的蛋白質,所以lysis buffer要強一點) 3.加lysis buffer to cell pellet(我大約都加150ul/(3*10)6 cell 4. vortex 2 minor longer 5. sonication 5 min 6. 4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min 7. transfer supernatant(原液) to new microtube 8. protein定量 (原液在取時有vortex,怕取不準) 9. 再次將原液離心,4度C 離心 13200 rpm or 16100 rcf , 10 min 10.搭配lysis buffer將原液稀釋到一定量(approximate 80 ug/well),這次原液離心第二次完,取出稀釋時,沒有vortex 11.加入sample buffer & DTT, 沸水中煮3 min 12.煮完後,直接loading 13.160V, 1hr (此時就看運氣了,有時很好,有時就會拖帶很明顯) P.S 我想應該不是膠的問題,我是用現成的, Invitrogen NuPage ..希望大家幫我看看錯再哪了..謝謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.13.115.19

推

linker0726

04/14 20:50, , 1^F

04/14 20:50, 1^F

※ 編輯: killmebaby 來自: 163.13.115.19 (04/14 21:13)

推

runpapa0520

04/14 21:40, , 2^F

04/14 21:40, 2^F

推

melodyrabbit

04/15 13:46, , 3^F