[問題] 關於用CTAB法抽取細菌 total DNA
今天我做了total DNA extracion from bacteria的實驗
照理說最後應該會有DNA沉澱被delute出來
可是我完全看不到沉澱
應該是說明實驗失敗了(之前學姐帶我做的時候有很明顯的沉澱)
我實在不知道哪裡出問題 希望各位先進不吝指教
首先附上protocol:
1. Inoculate the colony into LB medium,shaking, incubate at 37°C O/N.
2. Centrifuge at 4000 rpm, 10mins, discard the sup.
3. Add 567μl TE buffer, pipetting until resuspended, add 30μl 10% SDS and
15μl proteinase K(20mg/ml), mix, incubate at 37°C at least 1hr.
4. Add 10μl 5M NaCl, mix well, than add 80μl CTAB/NaCl(5% w/v), mix, incubate
at 65°C, 10min.
5. Add equal volume of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), mix well,
centrifuge 4~5 min, put the sup into a new tube, add 0.6~0.8X isopropenol
until the DNA precipitate appears. Spin down, discard the sup.
6. Wash the precipitate with 1ml 70% alcohol, centrifuge, discard alcohol,
dry the sample at laminar flow, resuspend in TE buffer O/N.
我自己是在以下方面存在不確定的感覺
但是也不知道是否是失敗的原因
第一,我最一開始是取了1 ml 的菌液在eppendorf中離心,可是離出來的細菌好像不是很多
即使如此可能影響到實驗結果,但應該也不會"一點沉澱也沒有吧"?
第二,第五步說到的equal volume,我不知道有沒有誤解他的意思,我的認知是,假如
我的eppendorf中還剩下五百毫升的液體,我就加入五百毫升的
phenol/chloroform/isoamyl alcohol只是五百毫升中他們三者的比例是
25:24:1,這樣有錯嗎?
第三,同樣第五部說到的put the sup into a new tube應該指的是在移到另一管的
上清中加入 isopropenol吧?(這應該不會有錯吧)
因為沒有沉澱出現 我想應該是徹底失敗了
當然每一個步驟都會影響實驗的結果
只是我無法很犀利的找出問題的所在
因此很感謝大家的幫忙
再不然最壞的可能性
就是當初配藥的時候有問題= =
謝謝大家的幫忙
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推
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