[問題] 有人使用過DQ-gelatin這東西嗎?
我這兩個月在做insitu DQ-gelatin zymography的實驗,但是遇到種種的困難,
第一關於冷凍切片的厚度,通常一般冷切的厚度大概是20~40um這麼厚,但是根據paper
指出他們在切的時候是用10um,這是一個難度很高的事,因為基本上所取出來的腦組織
只用利用PBS灌流過,並沒有經過脫水和固定的步驟,因此在切片的時候組織非常容易
裂開或是破損,這個問題後來經過我的練習之後,仍然無法克服,但是後來我將切片的厚
度改為20um之後,就沒有這個問題了
第二就是關於DQ-gelatin的特性,基本上MMP會分解細胞外基質(也就是gelatin)所以這
個實驗就是將這個染劑(含有gelatin)用特定的buffer稀釋之後加在組織上面,放在37度之下overnight,
之後在螢光顯微鏡之下利用495nm波長的光線激發會發出綠色螢光,所以螢光的部份就是
MMP所在的位置,但是在paper的圖上即使沒有MMP表現的位置,也會有background的顏色,
可是我在做的時候並不明顯,所以不知道是什麼原因?
第三個問題是,當gelatin被分解後,發出螢光的peptide會不會留在MMP所在的位置?
因為在使用這個染劑的時候是在水溶液的狀況之下,所以不清楚被分解下來的peptide
(就是會發螢光的部份)會不會留在原本的位置?還是會漂來漂去?
拜託各位囉!!有經驗的人請幫幫忙吧!!
感激不盡~~
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