[問題] NotI digestion的問題

看板Biotech作者 (我討厭吃便當!!!!)時間17年前 (2007/03/06 04:21), 編輯推噓9(9推 0噓 4→)
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最近在做cloning 好不容易把100bp的insert弄進plasmid之後 現在又遇上了NotI不切的問題 我要做的是一個double digestion (BsrGI/NotI) 因為兩者buffer不一樣~所以先切BsrGI Qiagen kit purify之後再切NotI 之前有試過似乎要overnight才會切的比較好 但效果還是很差 我查過NEB的catalog說NotI是methylase sensitive 但是實驗室沒有Dam-/Dcm-的strain 想問大家有沒有人在這樣的情況下有比較好的方法 還是digestion overnight是唯一的方法呢? 對了，我現在用的是DH5 alpha competent cell 謝謝!!拜託高手幫忙~ -- 夜已晚的很美麗 天已亮的很分明 我在你的回憶裡 是黃昏還是黎明 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.180.7.220
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對了補充一下 RE也是NEB的
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NotI是CpG island sensitive,你上面的想法不是切不好的理由
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謝謝你~我應該是誤會了! 那請問有什麼方法可以解決嗎?
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NotI,含切位:24個base->90% cleavage @ 37度 20小時
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20個base以下->0~10% @ (同上條件)
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以上是針對 DNA fragments,基本上它是需要over night~
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謝謝你!!!那我還是努力的延長反應時間吧!
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請問有幾個切點???切太久也不太好 主要還是要看你的用途為何
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我的plasmid上只有一個NotI site,試過三個小時切不好
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請問已經做好的clone 要再把他切開來的目的為何?
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要把一段gene用另一個PCR產物取代~
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所以我vector跟PCR product都要用NotI切
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會不會沒加BSA啊?!
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