[問題] GST-Fusion Protein的純化

看板Biotech作者 (朝目標邁進)時間17年前 (2007/03/02 19:57), 編輯推噓11(11推 0噓 6→)
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用IPTG induction完 加triton sonication後離心的上清液 跑SDS-PAGE可明顯看到我要的 protein band 但用 glutathion sepharose 純化完 protein 濃度很低 以下是我的 protocol 將 glutathion sepharose 4B 4c.c. 裝入column wash 2X wish cold PBS wash 1X wish cold PBST 加 protein 上清液 (bind 2 hrs shack 4度C) wash 2X wish cold PBST wash 1X wish cold PBS elute wish 20mM glutathion reduced 請達人們幫我看看哪裡出問題 向各位求教了 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.163.64
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有沒有PAGE可以看一下?
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你elute buffer是在PBS還是Tris??
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還有一個可能是蛋白沒吸上
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03/03 01:27, , 4F
回2樓的~~是PBS裡 沒抓到蛋白 到底哪出問題???
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問題應該在lysis buffer的成分 另一方面 如果運氣夠差的話
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有的蛋白就是抓不下來 即使有被induce出來 這是很弔詭的
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GSH-shepharose是怎麼equibriment的? 如果只用2Xbuffer
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可能不太夠 建議用10x或是20X左右equibriment
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X是我洗的次數 2X就是說6ml PBS洗兩次
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樓上的前輩是說要洗個10到20次體積的PBS
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可能是lysis buf的問題,把flow thru和wash出來的都拿去跑膠
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如果你的protein沒有要在進一步的purify或與其他
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protein interaction，你可以直接加適量的SDS sample
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buffer去煮，跑SDS-PAGE來check
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是否有在2h內binding成功，wash後的上清液也可以確認
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沒抓到蛋白?所以拿Sepharose去loading也沒有protein?
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謝謝各位的解答 ^^~ 絕定先把triton改lysozyme破菌試試看
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