[問題] PCR 問題
【問題】：
如何找出PRIMER與template的condition
【問題起因】：
現在我有一組sample做為control，在這組control理論上是不會被primer
黏上，也就是應該 "不會有BAND" 出現
但跑出來結果有BAND產生，所以現在想法在於condition問題
以下這想法不確定正不正確
"只要condition合適，不論primer與template是不是在序列上有沒有match
有可能有"一定機率"做出產物"
也就是比如anneling溫度極低，使某CYCLE PCR不小心黏上做出東西
那麼這樣的錯誤就會被放大 (也就是該錯誤變成template，然後做出產物)
基於這樣的想法 (不確定這想法對不對)
要求證，想透過是否有軟體能計算
primer跟template在怎樣的條件下會match並做出primer
我有試過用mac vector，但似乎只會跟你講說
這primer不會match之類
(也有可能我操作不熟，或有我不知的方法)
而我要求的是在怎樣他們才會match，不論條件多極端
【個人看法】：
主要因為我實驗的PCR是在非常低的anneling溫度，想知道這樣條件是否就是問題
而同組control不同次的實驗 (一樣sample一樣condition，差別只在先後)
卻有不同的結果。
再盡力避免人為失誤之下，考慮是污染被放大的情況
也就是不正常環境下的match
感謝各位
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
推
02/23 13:33, , 1F
02/23 13:33, 1F
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02/23 13:35, , 2F
02/23 13:35, 2F
謝謝提供連結
我會試試看
V大提到梯度是指
梯度PCR嗎??
即比如annel溫度 44 44.5 45 45.5 46 46.5 .....
(同樣的solution，但不同anneal teamp)
這樣同時下去跑
之後跑GEL看BAND?
可我目前遇到 同樣的condition，卻前後結果不一
比如說 anneal temp = 45c
第一次出現band (在不該出現band的control)
第二次沒有band
..
.
.
因為如果問題在這裡 推測應該是primer穩定性的問題
即專一性+tm太低
目前是打算再一次回頭check所有condition
確定其中沒有受到汙染
另外有版友提到關於我這種 non-target control 問題會很多
排除汙染之後可能會來考慮這一步
非常感謝你
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/25 10:58)
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/25 10:59)
推
02/25 14:01, , 3F
02/25 14:01, 3F
可我就是稿不懂為甚麼....
比如其中一次TEST
我一次做兩批 control+實驗組
結果跑出來結果兩組不一樣(neg control組)
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.99 (02/25 21:17)
所以我才會傾向PRIMER專一性穩定性低
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.99 (02/25 21:18)
推
03/08 10:38, , 4F
03/08 10:38, 4F