[轉錄][問題]關於抽質體DNA的問題
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作者: wwwjjj (......) 看板: Biology
標題: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間: Mon Feb 16 21:05:24 2004
在下是剛進實驗室的新手
目前還是大學生
想請問各位大大
抽plasmid DNA的步驟中
在加入各種buffor,靜置..........
之後有一個步驟:離心後取澄清液
上面的解釋說此澄清液含有plasmid DNA
而沉澱物則包含了genomic DNA, proteins, cell debris, SDS ...
我想請問的是genomic DNA不是細菌除了plasmid外的DNA
兩者同樣是DNA只是大小.形狀的不同
為什麼plasmid DNA會溶解而genomic DNA卻會沉澱下來
不知道這樣形容會不會很模糊
thank you:)))
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◆ From: 163.25.118.10
作者 palan (燃燒吧!脂肪!) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Mon Feb 16 21:16:22 2004
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我不知道我記的對不對...
好像是在抽DNA的過程中
會使雙股的DNA打開成為單股
再令其重新配對
但genomic DNA比較大
所以重新配對回去不易 故沉澱..
作者 KLAHA (Scars of sabbath) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Tue Feb 17 20:42:55 2004
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聽你說法應該是用alkaline lysis
離下菌,去掉broth
soln 1 : GTE
菌的等張液,維持菌的完好
務必使菌完全懸浮
加soln 2：SDS和NaOH
SDS=detergent,破菌
NaOH=使DNA變性(denature),由雙股打開為單股型式
混勻即可,切勿劇烈混合使genome DNA斷裂
加soln 3：加酸(我用醋酸鉀)
中合soln2,務必混合均勻
此時plasmid DNA因片段較短,馬上renature
但genome DNA片段較大,不及馬上renature
離心,捨去懸浮(lipid)&沉澱物(protein,genome DNA等),取出液體
加入100% EtOH沉澱,離心
去除上清液(有genome DNA)
留pellet=plasmid DNA
以70% EtOH wash
乾燥後得plasmid DNA,
溶於適量水或TE buffer內
作者 zerpher (畫圈圈..ψ︶︿︶) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Wed Feb 18 01:29:37 2004
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其實這個觀念很多老師也這樣講過
我以前也這樣認為
直到被一個老師糾正後才知道不對
使用Alkaline Lysis 抽取 plasmid 的原理
是利用在一個小範圍的pH(12.0-12.5)
這時候linear DNA會denature
但CCC (covalently closed circular) DNA
(就是plasmid)"不會denature"
此時Chromosomal DNA is denatured
當我們將溶液中和以後Chromosomal DNA renature
並且和蛋白等巨分子糾結 然後可以被離心沉澱
這就是plasmid抽取的原理
附上一個網址 裡面介紹的還蠻詳細的
http://www.sfu.ca/bisc/bisc-429/Monday_29_september.htm
作者 KLAHA (Scars of sabbath) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Wed Feb 18 13:38:36 2004
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我去察了一下書(gene cloning 4ed/T. A. Brown),
順便看一下大學時寫報告參考的BCT網頁...
發現BCT網頁上的有錯哎...*汗*
http://juang.bst.ntu.edu.tw/BCT/Chapters/Chap2-1.htm#2.1
這個實驗是以 alkaline lysis 的方法進行，其原理是將細菌以 NaOH 及 SDS 分
解，並使蛋白質及 DNA 變性，繼之以酸中和。在此情況下，小分子質體 DNA 在
中和後可恢復原態，但大部份的細菌染色體 DNA 則無法完全復原而與 SDS-K+ 所
形成之複合物一起沉澱下，可以離心去除之，上清液中所含的質体則可以酒精或
異丙醇將其沉澱下來。
錯的是這一句"小分子質體 DNA 在中和後可恢復原態"
事實上是小分子質體 DNA以supercoiled form型式存在
所以在pH 12-12.5仍不denature
而non-supercoiled form的genome DNA則是在中合後因無法完全的回復
所以東牽西連成一個NETWORK..而生成複合物沉澱
所以重點是"supercoiled form 和non-supercoiled form"是否在pH12-12.5 denatured
還有coDNA ccDNA和 supercoiled應該是不一樣的(Topoisomerase 相關)
當然很多時候它們也是混用的
http://www-biology.ucsd.edu/classes/bimm100.FA00/07.ProkChrom.html
1. Common Examples in double-stranded DNA (dsDNA):
Linear:
break in backbone of both strands, opposite each other or close
If close, then have short region of single-stranded DNA (ssDNA)
Open circular:
break in one strand, other strand is closed circular ... ocDNA
Closed circular:
both strands are closed, no breaks
also called Covalently Closed Circular DNA (cccDNA or ccDNA)
Supercoiled DNA: ... [Brown, Fig 6.11]
covalently closed circular DNA contains helical structure
IN ADDITION to the Watson-Crick double helical structure ...
作者 puec.bbs@flight.bio.ncku.edu.tw (Schmalcel), 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 成大生物飛翔站 (Thu Feb 19 09:53:12 2004)
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http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/alkaline/alkaline.html
更有興趣的話:
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Red. Nov 24;7(6):1513-23
Ish-Homowicz D, Burke JF (1981) Rapid and efficient cosmid cloning.
Nucleic Acids Res. July 10;9(13):2989-98
作者 Lipaty ( ) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Thu Feb 19 15:24:34 2004
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DNA 和 protein 因為denature之後相互纏繞形成一個大型的分子
這個分子需要較多的水合(solvolysis)才能溶解
但是因為solution III加入以後發生中和 所以鹽度升高
這些鹽包括solution II裡的SDS 和sodium
當然還有solution III裡頭的potassium 和acetate
我要強調salt也是會溶解的
真正造成沉澱的原因是因為這些鹽的濃度升高 把原本應該和DNA-protein水合的
水分子搶走
造成水合不足 所以denature的DNA-protein complex才沉澱
這就是你看到白白的一駝的原因
而plasmid DNA分子比較小 不如chromosome DNA-protein 這個大分子
來的那麼需要水合
所以在這個鹽的濃度下 尚可以溶解
作者 Lipaty ( ) 看板 Biology
標題 Re: [問題]關於抽質體DNA的問題
時間 Thu Feb 19 23:25:03 2004
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在高pH值的情況下 管他是不是supercoiled form DNA都會denature
因為高OH-濃度會disturb double strand之間的 hydrogen bonding
在這個前提之下 沒有所謂supercoiled form DNA不會denature的道理
全部都會denature
跟結構嚴不嚴謹毫無關係
你頂多只能說supercoiled form DNA"比較"不容易denature
但那是在溫和的條件之下 高pH值一點都不溫和
必須強調沉澱是因為salting out
而不是因為形成complex
再說的更多一些 最後要沉澱plasmid不是也會加salt嗎?
可是plasmid沒有跟SDS-K形成complex阿 他還是沉澱了
以上說明了沉不沉澱是跟你用多少salt去破壞solvolysis
而不是complex是否形成在決定的
supercoil form一樣會denature
uncut的plasmid會有三個major band對吧?
其中只有一個是supercoil form的plasmid
另外兩個band都不是supercoiled form plasmid的
所以並不是只有supercoiled form才會被純化出來
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◆ From: 140.112.25.191
※ 編輯: enisx 來自: 140.112.25.191 (02/20 18:26)
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